黄连素和黄芪多糖对鸡源大肠杆菌的体外联合抑菌作用

胡文举，宋艳画，吴伶俐

（1.河南广播电视大学，河南郑州黄河路124号450008；2.河南农业职业学院，河南中牟 451450）

鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一组鸡的传染病，是目前危害养鸡业的重要传染病之一。鸡致病性大肠杆菌血清型复杂，变异迅速，耐药菌株不断地出现，使该病的防治十分困难。黄连素是黄连水提物的主要成分，对多种致病性细菌有不同程度的抑制作用，同时其具有不易产生耐药性、毒副作用小、药物残留低等特点，被广泛应用于胃肠道细菌性感染的治疗[1]。黄芪多糖是具有较强免疫活性的一类物质，具有促进免疫调节、抗病毒、抑菌等生物活性，作为免疫增强剂被广泛应用于养禽业中[2]。本文通过黄连素和黄芪多糖联合用药对鸡致病性大肠杆菌体外抑菌作用研究，评价其联合用药效果，为临床上二者联合使用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验药品 黄连素（纯度99%）、黄芪多糖（纯度80%）购自郑州市贺鑫生物技术有限公司；LB肉汤干粉培养基、LB琼脂培养基购自杭州百思生物技术有限公司。其余试验药品均购自郑州市医药市场。

1.2 试验菌株 试验标准菌株：鸡源大肠杆菌（C83845）购于中国兽药监察所；临床分离菌株（致病性大肠杆菌菌株3株）由郑州市某养殖场中采集病料，并进行分离、鉴定。

1.3 培养基制备 供试菌种培养基采用LB培养基。LB肉汤液体培养基和LB琼脂培养基均按照产品使用说明书配制。LB肉汤液体培养基配制完成后高压蒸汽灭菌，密封保存备用；LB琼脂培养基配制完成，进行高压蒸汽灭菌后倒入灭菌的培养皿中制成5mm厚培养板备用。

1.4 药液配制 精密称取黄连素和黄芪多糖（均折合成实际含量），用灭菌蒸馏水分别配制成8mg/mL和160mg/mL浓度的药液。药液配制完成后进行高压蒸汽灭菌，待药液冷却后在无菌条件下分装于灭菌的EP管中，置于-20℃冰箱中保存备用。

1.5 菌液的制备 用接种环蘸取菌株，加入含有一定量LB肉汤培养液的带塞试管中，做好标记，置于生化培养箱中37℃条件下培养18h；用接种环蘸取菌液，划线接种于含有LB琼脂培养基的培养皿中，置于生化培养箱中37℃条件下培养18h；用接种环挑取单个菌落，接种于2.0mLLB肉汤培养液中，置于生化培养箱中37℃条件下培养6h，用生理盐水以10倍稀释法依次进行稀释，选取适当浓度的菌液0.1mL，置于含有LB琼脂培养基的培养皿中，用无菌接种环涂抹均匀，置于生化培养箱中37℃条件下培养18h，计算菌落数。根据菌落数计算稀释倍数，用生理盐水将菌落稀释至2×105CFU/mL后备用[3]。

1.6 单药MIC测定 用试管采取倍比稀释法测定最小抑菌浓度（MIC），药物抑制大肠杆菌生长的最小浓度为最小抑菌浓度。取12支试管，每管加入1.0mLLB肉汤培养液，再在第一管中加入1.0mL配置好的药物原液（根据预试验结果选择药物浓度），充分混合均匀后取出1.0mL放入第2管，充分混合均匀后取出1.0mL放入第3管，依此类推，直至第10管，第11管作阳性对照，第12管做阴性对照。完成后除第12管外其余每管加入1.0mL菌液，使菌液的浓度为1×105CFU/mL。将所有试管置于生化培养箱中，37℃条件下培养24h后观察结果。轻摇试管见絮状浑浊者为抑菌阴性，澄清者为阳性。呈阳性所含的最低药物浓度即为MIC[4]。整个过程重复操作2次，最终所测药物MIC值取2次平均值。

1.7 联合药敏试验 将黄连素和黄芪多糖用LB肉汤培养液倍比稀释，按棋盘法设计，两两组合加入一次性96孔板上。药物采用6个稀释梯度，最高浓度为其单药MIC的2倍，依次倍比稀释。药物按浓度各取50μL按纵列和横列进行各浓度两两联合，完成后每孔再加入100μL菌液，使菌液的浓度为1×105CFU/mL。将96孔板置于生化培养箱中，37℃条件下培养24h后观察结果。大肠杆菌生长指标同单药药敏试验。无菌生长的最低药物浓度为联用时药物的MIC[5]。

1.8 结果判定 以部分抑菌浓度指数FIC作为联合药敏试验的判断依据。FIC≤0.5表示有协同作用，0.5

FIC=（甲药联用 MIC/甲药单用 MIC）+（乙药联用MIC/乙药单用MIC）

2 结果

2.1 单药的抑菌作用 黄连素和黄芪多糖单用对大肠杆菌的MIC见表1。由表1可见，单独使用黄连素对各菌株的MIC变化范围比较大，说明各菌株对黄连素敏感性差异较大。单独使用黄芪多糖对各菌株的MIC为10mg/mL～15mg/mL。

2.2 联合用药的抑菌作用 见表1。由表1可知，黄连素和黄芪多糖联合使用对鸡源大肠杆菌的平均FIC为0.91，说明两者药物对鸡源大肠杆菌抑菌作用整体上呈相加作用，但对于临床菌株3两者呈无关作用。

3 讨论

本研究结果表明，黄连素对4株鸡源大肠杆菌MIC最低为0.375mg/mL，最高为1.0mg/mL。张涛等研究表明，黄连素对大肠杆菌体外MIC为1.0mg/mL[6]。刘玉庆等的研究结果为2.5mg/mL[7]。造成各研究结果之间差异较大的原因可能是供试菌株不同。这提示黄连素对大肠杆菌的体外抑菌效果因菌株不同而存在差异。

对于黄芪多糖的体外抑菌作用，杨玉艾等的研究认为，黄芪多糖在体外对链球菌、大肠杆菌和金黄葡萄球菌均有一定的抑菌作用，且抑菌作用与浓度呈正相关，其对大肠杆菌有效抑菌浓度为6.6mg/ml[2]。本研究得到了与其相似的结果。刘永录等研究也认为黄芪多糖有一定的抑菌作用，但其认为在20mg/ml条件下抑菌效果最好[8]。这与杨玉艾及本研究结果有较大差异。从本实验结果看，黄芪多糖对鸡源大肠杆菌的MIC为10～15mg/mL。这提示黄芪多糖在体外有一定的抑菌效果，但效果较弱，说明黄芪多糖在体内对大肠杆菌的抑菌作用可能是通过其他途径实现的。

表1 黄连素和黄芪多糖单用及联合对鸡源大肠杆菌的MIC和FIC

本实验采取棋盘法进行了黄连素和黄芪多糖对4株鸡源大肠杆菌的体外联合药敏试验。试验结果发现，两种药物联合使用在3株菌株中呈现相加作用，1株菌株呈现无关作用。通过联合用药，使黄连素的抗菌活性提高了2～8倍，黄芪多糖的抗菌活性提高了1～2倍。说明在有效抑菌的基础上，两者联合用药能够大大减少药物的使用量。本研究结果为临床上两药联合使用治疗鸡源大肠杆菌病提供了理论依据。

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