复方中药对奶牛子宫内膜炎主要病原菌体外抑菌试验的研究

娄志伟，王 爽，李玲玲 ，张鹏宇，王文彪 ，和翀翼*

（1.宠爱一生宠物医院，黑龙江哈尔滨 150030；2.黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔，161003；3.哈尔滨大江牧业科技有限公司，黑龙江哈尔滨 150038；4.天津艾森生物工程有限公司，天津静海县天宇科技园5号 301609）

奶牛子宫内膜炎（endometritis）是指炎症仅局限于子宫内膜的病理过程[1]，是奶牛最常见的产科疾病之一，也是造成奶牛不孕的主要原因之一。其发病率极高，国外统计其发病率平均为30%～40%，我国统计为 20%～50%[2、3]。引起奶牛子宫内膜炎的微生物有细菌、病毒、真菌、支原体等，但以细菌感染较为常见。我们对奶牛子宫内膜为主要致病菌进行药物敏感性试验，旨在为临床选择安全有效药物提供理论依据与试验支持。

1 试验材料

1.1 试验药品与试剂 金银花、黄连、黄柏等中药购于天津市老百姓大药房；营养琼脂培养基、营养肉汤及生化试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 试验菌种 化脓链球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌分离鉴定于黑龙江八一农垦大学临床教研室。

1.3 试验设备 DRP-9082型电热恒温培养箱（上海森信仪器有限公司）；DGG-9070B型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信仪器有限公司）；BCN-1360B型生物洁净工作台（天津市生物洁净仪器厂）

2 试验方法

2.1 复方中药的组方与制备 选取金银花、连翘、黄连、黄柏、大青叶、蛇床子、苦参、益母草、甘草、川芎、五灵脂、当归十二味中药进行组方。试验I：金银花、连翘、黄柏、蛇床子、益母草、川芎、当归、甘草适量组成。试验II：金银花、连翘、黄连、大青叶、苦参、益母草、五灵脂、甘草适量组成。并对复方中药进行提取，浓缩至1g/ml，微孔滤膜过滤，流通蒸汽灭菌30min后备用。

2.2 菌液的制备 将分离鉴定出的病原菌种接种入THB肉汤或普通肉汤（链球菌接种于THB肉汤，其它接种于普通营养肉汤），37℃活化24h后，采用麦氏比浊法，用THB肉汤和普通肉汤将细菌县液稀释至浊度为106CFU/ml备用。

2.3 体外抑菌试验

2.3.1 试管二倍稀释法 分别测定复方中药对化脓链球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。取灭菌试管10支，编号，于1～9管中各加入无菌肉汤培养基或THB肉汤2ml（链球菌接种于THB肉汤），然后于第1管中加入1g/ml的受试中药提取液2ml，混匀后取出2ml加入第2管，依此类推，直至第8管中取出2ml弃去，第9管为空白对照，第10管为药液对照。然后1～9管中加入供试菌液或混合菌液0.1ml，摇匀，置37℃恒温箱中培养18h。以不发生浑浊变化的最高药物稀释倍数作为该药物的MIC值。将所有清晰无菌生长的试管营养液接种于营养平板或THB平板，培养24h，以菌落数不超过5个的最低药物浓度作为该药物的MBC值。根据MIC值和MBC值评价中药的体外抗菌活性。

2.3.2 打孔法 取供试菌液0.8ml倾于普通琼脂平板表面（链球菌需THB琼脂平板），使其均匀平铺于表面。弃去多余的菌液，置37℃干燥15min，打孔器打孔（直径6mm）后，在酒精灯火焰上稍微烘烤后，每孔加满药液（不能溢出），37℃培养24h，观察并记录复方中药对种种细菌抑菌圈直径的大小（mm），每种药物作四个重复。

3 试验结果

3.1 复方中药对各种细菌的MIC和MBC试验结果

对奶牛子宫内膜炎主要致病菌进行中药试管二倍稀释法试验，试验结果见表1，由表1可知：试验I组对五种病原菌的抗菌活性较强，MIC及MBC达到8～64mg/ml，试验II组对除金黄色葡萄球菌外的四种病原菌的抗菌活性也较强，MIC及MBC达到16～64mg/ml。

3.2 复方中药对各种细菌的体外抑菌试验结果

注：抑菌效果判定标准按《中药药理学》标准：抑菌直径>20mm为极敏，15～19mm为高敏，10～14mm为中敏，10mm以下为低敏，-表示无作用。

对奶牛子宫内膜炎主要致病菌进行中药打孔法试验，试验结果见表2，由表2可知：试验I组与试验II组对五种病原菌均有抑菌效果，均能达到中敏到高敏。

4 分析与讨论

中兽医学认为奶牛子宫内膜炎属于带下症的范畴，分析其原因一是由于饲喂失调，劳役过度，损伤脾气，使运化失常，不能化水谷为精微，反聚而为湿，湿浊下注；或肾气亏虚，以致肾失闭藏，带脉失约，使津液滑脱而下；二是由于脾虚湿盛，反而侮肝，肝郁化火，致湿热下注；三是由于外邪入侵，如配种及人工授精不洁，助产不卫生，邪毒客于胞宫之内，与气血相搏，因而发病，或产后恶露不尽，或胎衣残留胞宫，致使瘀血停滞胞宫之内，瘀久化热而致病。

表1 复方中药对各种细菌的MIC和MBC试验结果（单位：mg/mL）

表2 复方中药对各种细菌的体外抑菌试验结果 （单位：mm）

药有个性之特长，方有合群之妙用。试验I以金银花、连翘、黄柏抑菌杀菌为主药，蛇床子、益母草温肾助阳，兼具杀虫之效为辅，佐以川芎、当归活血行气，以甘草为使；试验II以金银花、连翘、黄连抑菌杀菌为主药，辅以益母草温肾助阳，五灵脂化瘀止血、活血止痛，苦参、大青叶为佐，以甘草为使。药物共奏抑菌杀菌、活血止痛、解毒消肿、祛腐生新之功效。

中药对主要病原菌抑菌试验中选取试管二倍稀释法与打孔法，对于抑菌作用较强的药物用打孔法其效果可能被掩盖，用试管二倍稀释法比较精确，但有些中药提取液本身色泽深、混浊度大，在试管内培养后不易观察，因此，本试验综合两种药物的抑菌作用，试验结果基本一致。试管二倍稀释法试验结果表明：试验I组对五种病原菌的抗菌活性较强，MIC及MBC达到8～64mg/ml，试验II组对除金黄色葡萄球菌外的四种病原菌的抗菌活性也较强，MIC及MBC达到16～64mg/ml。打孔法试验结果表明：试验I组对蜡样芽孢杆菌为极敏效果，对大肠杆菌及乳房链球菌达高敏效果，对化脓链球菌及金黄色葡萄菌均为中敏效果；试验II组对五种致病菌均为中敏效果。综合以上试验结果，筛选试验I组进行下一步试验。

[1] 林 羲.家畜病理学（第三版）[M].北京：中国农业出版社，2001：184-185.

[2]赵红琼.新疆奶牛子宫内膜炎病原菌的分离鉴定及其治疗中草药的筛选.新疆农业大学硕士论文[D]，2005，6.

[3]弓素梅.治疗奶牛子宫内膜炎中药栓剂的研究[D].河北农业大学硕士论文，2006.