绿汁发酵液与纤维素酶对王草青贮品质的影响
2013-12-01周汉林刘国道
张 英,周汉林,刘国道,王 坚
(1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,海南 儋州 571737;2.中国热带农业科学院热带草业与畜牧研究所,海南 儋州 571737; 3.海南大学农学院,海南 儋州 571737)
绿汁发酵液与纤维素酶对王草青贮品质的影响
张 英1,2,3,周汉林1,2,刘国道1,2,王 坚3
(1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,海南 儋州 571737;2.中国热带农业科学院热带草业与畜牧研究所,海南 儋州 571737; 3.海南大学农学院,海南 儋州 571737)
本研究探讨了绿汁发酵液与纤维素酶对王草(Pennisetumpurpureum×P.americanum)青贮品质的影响。试验设对照组(CK)、绿汁发酵液处理组(PFJ)、纤维素酶处理组(CEL)和绿汁发酵液+纤维素酶混合处理组(PC),分别贮藏1、2、3、5、7、14和30 d后开罐,分析其pH值、挥发性脂肪酸、氨态氮和可溶性碳水化合物等成分的含量。结果表明,各处理对王草青贮后的干物质含量无明显影响;pH值均在第1天内快速下降,第5天时达到最小值,且在整个青贮过程中各添加组的pH 值均显著低于对照组(Plt;0.05);添加组的乳酸含量在第1天时快速升高,随发酵时间的延长,乳酸、乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸的含量以及AN/TN值都在升高,PFJ与CK组中丁酸含量的变化趋势相反,而PC组在整个青贮过程均未检测到丙酸与丁酸;PC组还兼具PFJ 组提高粗蛋白含量与CEL 组降低中性洗涤纤维含量增加可溶性碳水化合物含量的优势。综合考虑,混合添加绿汁发酵液与纤维素酶对王草青贮发酵品质的改善效果最好。
王草;青贮品质;绿汁发酵液;纤维素酶
王草(Pennisetumpurpureum×P.americanum)是由象草(P.purpureum)与美洲狼尾草(P.americanum)杂交的多年生禾本科狼尾草属牧草。王草因具有生长迅速、产量高、适口性好等特点而被广泛种植于热带亚热带地区,目前已经在我国海南、广东、广西、江西、云南、四川、福建等地推广种植[1]。2000年底,王草推广面积超过5万hm2[2]。王草主要用于刈割青饲或调制青贮饲料,由于王草雨季生长迅速而旱季、冬春季停止生长,造成家畜青饲料供求不平衡,缺乏青饲料时需要更多成本购买精饲料维持家畜生长,而雨季生长过剩的王草经青贮发酵后恰好可以弥补这一不足。
绿汁发酵液(Previosly Fermented Juice,PFJ)是一种与乳酸菌类似的青贮添加剂。PFJ具有制作工艺流程简单、生产成本低、环保等优点,较乳酸菌制剂而言,PFJ中存在适合于青贮原料发酵所需的各种乳酸菌菌种,添加PFJ后青贮效果较好[3]。目前已有较多关于添加纤维素酶(Cellulose enzyme,CEL)改善青贮发酵品质的报道[4-5]。孙娟娟等[6]指出添加纤维素酶可降解纤维组分生成乳酸菌发酵底物可溶性碳水化合物(Water Soluble Carbohydrates,WSC)。通过混合添加乳酸菌制剂与纤维素酶在乳酸菌大量繁殖的同时又有充足的发酵底物供给,可进一步提高青贮料的发酵品质[7]。本研究通过添加PFJ与CEL分析其对王草青贮发酵品质动态变化的影响,以期为提高王草青贮发酵品质的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1青贮原料 以热研4号王草(P.purpureum×P.americanumcv.Reyan No.4)为供试材料,于2012年6月13日采自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所畜牧研究中心十队实验田。王草干物质含量20.78%,水溶性碳水化合物含量7.56%,粗蛋白含量7.65%。
1.1.2添加剂 绿汁发酵液(天然乳酸菌接种剂,含有适合发酵的各种乳酸菌种以及部分大肠杆菌):称取150 g王草切碎后加入300 mL蒸馏水打浆,用四层沙布过滤,量取250 mL滤液加入5 g葡萄糖摇匀[8-9],密封保存于聚乙烯瓶中,于30 ℃下恒温发酵48 h[10],即得王草绿汁发酵液。
纤维素酶:酶活力≥15 000 U·g-1,购于国药集团化学试剂有限公司。
1.2试验方法
1.2.1青贮原料的制作 王草自刈割第2茬起生长57 d后刈割,将刈割好的王草用自动切草机切碎至1~2 cm,用四分法取样后分别设不同的处理组,包括对照组(CK)和添加组(PFJ、CEL、PC),各处理组添加成分如表1所示。随后混匀称取210 g快速装罐至300 mL实验室青贮窖(聚乙烯瓶)中,压实加盖并用黑胶带密封,分别在室温保存1、2、3、5、7、14和30 d后开罐取样,即为王草青贮样。每处理设3个重复,即3罐,共计84个青贮发酵罐。
表1 不同处理添加水平Table 1 Levels of the experimental additives
注:CK、PFJ、CEL和PC分别为对照组、绿汁发酵液处理组、纤维素酶处理组和绿汁发酵液+纤维素酶混合处理组。下同。
Note:CK,PFJ,CEL and PC are coutrol,treatment of previosly fermented juice,treatment of cellulase and treatment of previosly fermented+cellulase,respectively.The same below.
1.2.2样品处理 青贮罐打开后去除上层霉变的王草,将青贮料全部取出,充分混匀。准确称取20 g王草青贮样于三角瓶中,加入180 mL蒸馏水,搅拌均匀,于4 ℃下浸提24 h后用4层纱布过滤,滤液用定量滤纸过滤两次,所得浸提液保存于-20 ℃冰箱中备用。余下全部青贮料在65 ℃烘箱中干燥48 h,用于测定干物质(DM)含量[11],烘干后的青贮料用粉样机粉碎,过1 mm筛,草粉样密封保存于-20 ℃冰箱中备用。
1.2.3青贮饲料分析项目与测定方法 将青贮饲料于65 ℃烘箱中干燥48 h直到质量恒定,于干燥器中冷却,称其质量得干物质含量[12];可溶性碳水化合物(WSC)采用蒽酮-硫酸比色法测定[13];中性洗涤纤维(Neutral Detergent Fiber,NDF)与酸性洗涤纤维(Acid Detergent Fiber,ADF)用范氏纤维分析法测定[14];总氮(Total Nitrogen,TN)采用半微量凯氏定氮法测定[15];pH值用pH计对青贮料浸提液直接测定;氨态氮(Ammonia Nitrogen,AN)采用笨酚-次氯酸钠比色法测定[16];有机酸[乳酸(Lactic Acid,LA)、乙酸(Acetic Acid,AA)、丙酸(Propionic Acid,PA)、丁酸(Butyric Acid,BA)]用高效液相色谱法(HPLC)测定,色谱条件为采用COMOSIL5C18-PAD色谱柱(4.6 mm×250 mm)进行二元梯度洗脱,流动相A为20 mmol·L-1NaH2PO4(H3PO4调pH 2.65),B为甲醇;起始流动相为100% A,维持5 min,到8 min为90% A、10% B,维持14 min,最后在22 min时恢复起始浓度,平衡柱子,进下一个样,其中流速1 mL·min-1、柱温30 ℃、检测波长215 nm、进样体积20 μL。
1.3数据分析 用Excel软件进行数据的计算和处理,用SAS 9.0统计软件中的方差分析程序对处理后的数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1王草发酵过程中pH值、有机酸以及AN/TN值的动态变化 所有处理的pH值都有相同的变化趋势。在发酵初期的1 d内各处理的pH值迅速下降到4.2以下,且随后几天也显著下降(Plt;0.05),至发酵第5天,各处理pH值均达到最小值,并且各添加组pH值均显著低于CK组。随发酵时间的继续延长,各处理组的pH值又略有回升,发酵第14~30天,各处理的pH值差异不显著,且CK组各个发酵时间的pH值均高于或显著高于其它处理组。发酵结束后,PFJ组pH值显著低于其余处理组,CEL与PC组差异不显著(表2)。
王草青贮动态过程中,各处理的LA含量也有相似的变化趋势(表2)。添加组的LA上升幅度均在发酵开始的1 d内达到最大值,而CK组的LA则在第2天迅速上升(Plt;0.05),各处理组LA含量随发酵时间延长而不断升高,且添加组LA含量均高于CK组,PC组LA含量最高且显著高于CK组。与LA不同,AA在发酵第1天很少生成,整个青贮过程中,PC组AA含量呈上升趋势,其余各组的AA含量上升到第5天时略有降低,随后又不断升高。发酵到最后,CK组AA含量显著高于其余处理组,而PC组显著低于其余处理组。在整个青贮过程中,各处理在各个发酵时间的LA/AA值均大于1,CK组LA/AA值显著低于各添加组,发酵初期PFJ组LA/AA值最高,随着发酵进行,各组LA/AA值不断降低,至7 d以后降低幅度减小,30 d时PC组LA/AA值显著高于其余各处理组。
表2 王草青贮发酵品质Table 2 Fermentation quality of King grass silages
注:同列不同小写字母表示相同处理不同青贮时间之间差异显著(Plt;0.05);同行不同大写字母表示相同的发酵时间不同的处理间差异显著(Plt;0.05 )。下同。
Note:Different lower case letters within the same column indicate significant difference among different storage time for the same treatment at 0.05 level;different capital letters within the same row indicate significane difference among different treatments for the same storage time at 0.05 level.The same below.
PA在整个发酵阶段很少产生,其中PC组从发酵开始到发酵结束均未检测到PA(表3)。PFJ组在发酵前7 d也未检测到PA,发酵第14天以后有少量PA生成。CK组与CEL组的PA变化与pH值相似,都在第5天时到最低,随后又升高。PC组未检测到BA,其余各处理组BA含量也较低,其中,CEL组在发酵7 d后有少量BA生成,而CK组与PFJ组的BA变化趋势完全相反,CK组BA随发酵进行不断升高,而PFJ组BA含量的变化则与之相反。总VFA含量的变化趋势与AA相似,均是在发酵初期含量较低,随后除个别时间段略有波动外,总体呈上升趋势,发酵到最后CK组的总VFA含量显著高于其余处理组(Plt;0.05),PC组总VFA含量最低。
表3 王草青贮发酵品质Table 3 Fermentation quality of King grass silages
注: “-”表示未检测到。
Note:“-” indicates corresponding item did not find in the treatment.
表4 王草青贮饲料的化学成份Table 4 Chemical composition of King grass silages g·kg-1
CK组与PFJ组的AN/TN值随青贮时间延长呈升高趋势,CK组在发酵结束时AN/TN值显著高于各添加组(Plt;0.05)。CEL组与PC组AN/TN值的变化除个别发酵时间有波动外,总体呈上升趋势。发酵末期,PC组与CEL组的AN/TN值显著低于CK组与PFJ组(表3)。
2.2DM、WSC、CP以及NDF、ADF含量的变化 PFJ组与PC组整个发酵过程的DM 含量差异不显著(Plt;0.05),CK组与CEL组发酵期间DM 含量有略微波动,经30 d青贮发酵后,各处理间DM 含量差异不显著(表4)。
3 讨论
3.1绿汁发酵液对王草青贮品质的动态影响 本研究采用实验室聚乙烯瓶充当小型青贮窖,其密封性较好,几乎没有青贮料发酵液的流失,因此至发酵结束各处理的DM 含量变化很小。
绿汁发酵液是青贮原料经发酵制得的乳酸菌发酵液,它能较好地适应原料的青贮发酵。王草添加PFJ后,pH值在发酵初期快速降到4.0以下并在整个发酵过程中显著低于对照组。从发酵第1天起,PFJ组的乳酸含量远大于对照组(Plt;0.05),而挥发性脂肪酸、氨态氮的含量则显著低于对照组(Plt;0.05),还减少了AN/TN值。在发酵初期,PFJ组中丁酸含量显著高于对照组(Plt;0.05),这可能是由于绿汁发酵液添加剂在制作过程中产生了少量酪酸菌或丁酸。添加绿汁发酵液后乳酸菌迅速大量繁殖,同时也抑制了羧酸菌、酪酸菌等有害微生物的活性,降低了蛋白氮的分解。本研究表明,添加绿汁发酵液改善了王草青贮发酵品质,这也验证了唐维新[9]对绿汁发酵液的相关研究。许庆方[17]研究表明,在苜蓿(Medicagesativa)青贮料中加入PFJ可以降低pH值,减少丁酸与氨态氮的含量,同时增加乳酸的含量。郑丹等[18]对杂交狼尾草青贮发酵品质的研究也得出类似的结论,添加PFJ后在抑制丁酸菌及其他有害微生物活性的同时还促进了同质乳酸菌的发酵,提高了杂交狼尾草青贮发酵的品质。添加绿汁发酵液后,乳酸菌的快速繁殖利用了大量可溶性糖,最终可溶性糖的含量低于对照组,但在青贮发酵结束后还有剩余的可溶性糖,表明王草本身有足够的发酵底物供其青贮发酵。在整个青贮过程中,PFJ组的粗蛋白含量都显著高于CK组(Plt;0.05),杨亚文等[19]、雷宇杰和黄光玲[20]发现通过微生物发酵可提高发酵原料中的粗蛋白含量,但添加绿汁发酵液后对酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维的含量几乎没影响。
3.2纤维素酶对王草青贮品质的动态影响 有相关报道指出,纤维素酶在青贮中的利用效果不尽相同。Jacobs和Mcallan[5]发现,添加纤维素酶到苜蓿中青贮可有效降低青贮料中酸性洗涤纤维与中性洗涤纤维的含量。Selmer-Olsen等[4]指出,加入纤维素酶可降低黑麦草(Loliumperenne)青贮料的pH值及氨态氮、NDF和ADF含量,增加乳酸含量。但Kung等[21]添加纤维素酶对3个不同生长阶段的大麦(Hordeumvulgare)和野豌豆(Viciasepium)进行青贮表明,仅pH值有所降低,NDF和ADF含量均没有改变,对青贮饲料发酵品质的影响不明显。Sheperd与Kung[22]的研究结果表明,纤维素酶对玉米(Zeamays)青贮过程中的有机酸无影响。添加纤维素酶出现不同效果的原因很多,与青贮原料、贮藏温度、酶的使用水平以及含水率等因素相关。酶对温度、湿度、酸碱等条件敏感,在青贮过程中不易操控,易失活,并且各处理的酶活性也难统一,这都可能导致酶处理的青贮效果不同。本研究中添加纤维素酶对王草青贮品质的改善效果与绿汁发酵液几乎相同,在发酵初期显著降低了青贮料的pH值(Plt;0.05),乳酸菌迅速大量繁殖,降低了挥发性脂肪酸以及AN/TN值,对粗蛋白与酸性洗涤纤维的含量影响不显著(Plt;0.05)。但不同的是,在发酵初期可溶性糖含量显著高于CK组与PFJ组(Plt;0.05),还降低了中性洗涤纤维的含量,这可能是由于纤维素酶降解了纤维素并转化成乳酸菌的发酵底物,Colombatto等[23]也得到类似结果。这也可能是致使发酵初期CEL组的乙酸含量显著高于PFJ组的原因,发酵初期充分的发酵底物在大量促进乳酸菌生长的同时也促进了部分乙酸菌的生长。
3.3混合添加绿汁发酵液与纤维素酶对王草青贮品质的动态影响 混合添加绿汁发酵液与纤维素酶后在乳酸菌快速繁殖的同时,纤维素酶又间接为其提供了充足的发酵底物,这可能是由于乳酸菌与纤维素酶的混合添加产生了叠加效应[7]。目前已有许多关于混合添加酶与乳酸菌制剂能最大改善青贮发酵品质的报道[24-25]。王草中混合添加绿汁发酵液和纤维素酶后使乳酸含量与LA/AA值高于或显著高于单独添加绿汁发酵液与纤维素酶的处理组(Plt;0.05)。乳酸菌的迅速繁殖生成大量乳酸抑制了酪酸菌等有害微生物的生成,最终其总挥发性脂肪酸、AN/TN值在各处理组中最低,整个发酵过程中未检测到丙酸和丁酸产生,另外还兼具PFJ组与CEL组的优势,提高了粗蛋白的含量,与CEL组一样,在发酵初期有较高可溶性碳水化合物。PC组AA含量显著高于PFJ组,而PC组AA含量与CEL组差异不显著,还降低了中性洗涤纤维的含量,但对酸性洗涤纤维无显著影响。
4 结论
本研究表明,添加绿汁发酵液、纤维素酶和绿汁发酵液+ 纤维素酶3 种处理都可以改善王草青贮发酵品质,均能快速降低青贮料的pH值,使乳酸菌快速繁殖,降低挥发性脂肪酸、氨态氮的含量。混合添加的处理还能兼具添加绿汁发酵液提高粗蛋白含量与添加纤维素酶降低中性洗涤纤维含量增加可溶性碳水化合物含量的优势,因此,绿汁发酵液与纤维素酶混合处理在改善王草青贮发酵品质上效果最好。
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(1.Tropical Crop Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agriculture Science, Danzhou 571737, China;2.Tropical Grassland and Animal Science Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural sciences, Danzhou 571737,China; 3.College of Agriculture, Hainan University, Danzhou 571737, China)
Liu Guo-dao E-mail:liuguodao@scuta.edu.cn
EffectsofprevioslyfermentedjuiceandcelluloseenzymeonthedynamicfermentationchangesofKinggrasssilages
ZHANG Ying1,2,3, ZHOU Han-lin1,2, LIU Guo-dao1,2,WANG Jian3
This study is to evaluate effects of adding previously fermented juice and cellulose enzyme on the fermentation quality of King grass silages. The experimental treatments were CK(no additive), PFJ(previously fermented juice), CEL(cellulose enzyme)and PC(previosly fermented juice and cellulose enzyme). Silos were opened after seven ensiling periods(1, 2, 3, 5, 7, 14 and 30 days of ensiling)and the fermentation qualities(pH value, VFAS, the contents of ammonia-N and WSC and other chemical composition)were analyzed. All treatments did not influence the DM after ensiling. There was well reflected faster and larger pH decline and lactic acid production during the first day of ensiling and the lowest pH value in the 5th day of ensiling. All additive treatments had a significantly(Plt;0.05)lower pH value than CK. Lactic acid, acetic acid, propionic acid, total volatile fatty acid content and AN/TN value rose gradually, and the change of butyric were contrary in between PFJ and CK. Propionic acid and butyric acid were not found in PC, PC also hold concurrently the advantage of PFJ improved crude protein content and CEL reduced neutral detergent fiber content to increase water soluble carbohydrate content. These results showed that mixing add previosly fermented juice and cellulose enzyme to the silage was the optimum for fermentation quality of King grass.
King grass; silage; previosly fermented juice; cellulose enzyme
Zhou Han-lin E-mail:zhouhanlin8@163.com
S816.6
A
1001-0629(2013)10-1640-08
2013-01-14 接受日期:2013-03-07
中央级公益科研院所基本科研业务专项(PZS066);中国热带农业科学院院本级项目(1630032012049);国家现代牧草产业技术体系(CARS-35);农业部热带作物种质资源利用重点开放实验室开放基金“热带主要栽培牧草青贮发酵特性研究(KFKT-2011-10)”作者简介:张英(1987-),女,四川威远人,硕士,研究方向为热带牧草栽培。E-mail:janecy0728@126.com
周汉林(1971-),男,湖北浠水人,研究员,硕导,主要研究方向为热带牧草生产与反刍动物营养。 E-mail:zhouhanlin8@163.com刘国道(1963-),男,云南腾冲人,研究员,博士,主要从事热带牧草种质资源研究。E-mail:liuguodao@scuta.edu.cn