两种杀菌剂对中华羊茅种传内生真菌的影响

姚 祥，李秀璋，朱小晓，李春杰

(1.草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020;2.兰州市五泉山公园,甘肃 兰州 730020)

两种杀菌剂对中华羊茅种传内生真菌的影响

姚 祥1，李秀璋2，朱小晓2，李春杰1

(1.草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020;2.兰州市五泉山公园,甘肃 兰州 730020)

以我国高寒地区优良耐寒牧草中华羊茅(Festucasinensis)为研究对象，分析了两种内吸性杀菌剂在不同浓度和时间处理下对中华羊茅种传内生真菌的影响。发芽试验结果表明，两种杀菌剂的最适宜处理时间为8 h；甲基托布津(TM)的有效处理浓度为500倍和300倍，苯醚甲环唑(D)的有效处理浓度为1 000倍和3 000倍。对种子进行浓度和时间组合处理结果表明，幼苗带菌率从高到低依次为3 000 Dgt;500 TMgt;300 TMgt;1 000 D，发芽率从高到低依次为300 TMgt;500 TMgt;3 000 Dgt;1 000 D。甲基托布津稀释300倍和500倍液具有显著(Plt;0.05)杀菌效果而不影响种子萌发，使幼苗带菌率从98%分别降低到7%和10%。而苯醚甲环唑1 000倍和3 000倍处理8 h可显著降低种子发芽率(Plt;0.05)，从79%分别降低到54%和63%；并显著降低其带菌率(Plt;0.05)，由98%分别降低到5%和30%。因此，甲基托布津稀释300～500倍浸泡种子8 h为剔除中华羊茅种传内生真菌的最佳方法。

内生真菌；中华羊茅；内吸性杀菌剂；发芽率；带菌率

内生真菌(Neotyphodium)是一类在植物体内度过某个生命阶段并且能够在植物组织中增殖而不引起宿主植物明显伤害的真菌[1]。在自然生态系统中，全世界温带禾草中可能有10%的种类带有内生真菌[2]，内生真菌与禾草共生，一方面可提高禾草抗逆性，而另一方面却会使草食动物中毒，影响家畜健康[3]。因此，禾草内生真菌共生体对整个生态系统有非常重要的影响。

中华羊茅(Festucasinensis)是禾本科羊茅属多年生疏丛型草本植物，是我国西北、青藏高原、华北和东北等地常见的野生优良牧草，具有抗寒等特性[4]，也是高寒地区冬春季节放牧家畜利用的多年生栽培草地的主要草种之一。在高寒牧区草地建设、畜牧发展和生态治理工程中有着十分显著的优势[5]。中华羊茅在不同地方带菌率不同，在甘肃山丹、夏河等地内生真菌的带菌率为4.5%～100%[3]。关于中华羊茅-内生真菌共生体互作关系，研究发现中华羊茅内生真菌具有显著的形态学[6]、生物学和生理学多样性[7]，在胁迫环境下内生真菌可以促进种子萌发[8]和增强其耐寒性[5]。

为了更好地阐明内生真菌禾草共生体的互作关系，建立不带菌种群显得尤为必要。目前，高温、高湿方法[9-13]可以有效地除菌，但宿主植物活力有不同程度的下降[14]。杀菌剂的除菌效果较好，但高浓度的杀菌剂也会不可避免地引起幼苗的伤害[15]。以往研究表明，甲基托布津拌种草地早熟禾(Poapretensis)可增加其田间生物量[16]， 苯醚甲环唑拌种大麦(Hordeumvulgare)可有效防治大麦条纹病，并且不影响其出苗和生长[17]。本研究通过两种优良内吸杀菌剂不同浓度与时间配比的筛选，获得可除去禾草体内内生真菌而不影响宿主生长的适宜杀菌剂及其处理方法。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料 本试验所需的植物材料中华羊茅种子，2011年9月采于甘肃夏河，经李春杰等[18]的方法检测种子带菌率为98%，为保持内生真菌的活力，种子保存于4 ℃冰箱。用于检测带菌率的幼苗由上述种子的出苗生长而获得。

1.1.2配制液体杀菌剂所需材料 内吸性杀菌剂为70% WP甲基托布津(Thiophanate-methyl,TM)和10% WDG苯醚甲环唑(Difenoconazole,D)，购买于甘肃种子市场大地农药店。

1.2试验方法

1.2.1杀菌剂处理浓度与时间筛选 本试验采用杀菌剂浓度和时间两因素处理，包括两种杀菌剂的5个浓度梯度和时间的4个梯度，甲基托布津的浓度依次是对照(CK)、稀释1 000倍TM(1 000TM)、800倍TM(800TM)、500倍TM(500TM)、300倍TM(300TM)；苯醚甲环唑浓度依次是对照(CK)、稀释7 000倍D(7 000D)、6 000倍D(6 000D)、3 000倍D(3 000D)、1 000倍D(1 000D)。在实验室内分别用不同浓度的两种杀菌剂对中华羊茅种子进行浸泡处理，同时用无菌水浸泡作为对照处理，每个处理设1、4、8和10 h共4个时间梯度，观察并统计中华羊茅种子的发芽率。

1.2.2杀菌剂对种子萌发、幼苗带菌率及其生长的影响 根据筛选试验结果排除过低杀菌剂浓度以及过短和过长时间的处理，选取可能有效的杀菌处理对种子进行再次处理，将再处理过的种子播种在兰州大学榆中校区的智能温室内(温室环境条件：温度白天25 ℃，夜间20 ℃，16 h光照8 h黑暗交替、光照8 000～10 000 lx，相对湿度70%)，种子播种于蛭石基质中，以浇营养液(1/2 Hoagland)[19]的方式培养，每2 d浇1次营养液。待种子出苗6周后进行带菌率检测[18]，将中华羊茅幼苗的叶片整体浸泡在10%NaOH溶液5 h，再用0.8%的乳酸苯胺蓝溶液染色，酒精灯加热数秒，光镜下检测，以带菌植株的数量除以该组用于检测的植株总数量即得到内生真菌带菌率。 根据White等[20]的方法，随机选取50株，将带菌丝的玻片放在Olympus BX51系统显微镜下(400×)拍摄出清晰的菌丝照片，测量出每张图片上所有菌丝的总长度，用菌丝的总长度除以图片面积即得到菌丝密度。待植株9周龄时，测量不同处理下的植株的株高和分蘖。

1.2.3统计分析 试验数据采用Excel进行常规分析和处理，利用SPSS 12.0进行统计分析，单因素采用ANOVA分析，双因素采用常规线性模型单变量分析。

2 结果

2.1杀菌剂处理浓度与时间筛选 随着浓度的增高和时间的延长，杀菌剂对种子发芽的抑制作用逐渐增强。除800倍甲基托布津浸种1 h对中华羊茅种子发芽有抑制作用外，1 000倍和8 00倍甲基托布津在其余各时间梯度对中华羊茅种子发芽无抑制作用，但是500倍和300倍甲基托布津在浸泡时间为10 h时显著降低了种子的发芽率(Plt;0.05)；而1、4、8 h时对种子萌发无显著抑制作用(Pgt;0.05)(图1)。7 000倍和6 000倍苯醚甲环唑在各时间梯度内对中华羊茅种子发芽无显著抑制作用，但是3 000倍和1 000倍苯醚甲环唑在浸泡时间为8、10 h时对中华羊茅种子发芽有显著抑制作用，而在1、4 h时无显著抑制作用(图2)。

图1 甲基托布津(TM)不同处理浓度和时间对中华羊茅种子发芽的影响Fig.1 Effects of different concentrations and time of thiophanate-methyl on seed germination of Festuca sinensis

注:CK、1 000TM、800TM、500TM、300TM分别表示对照和稀释1 000倍TM、800倍TM、500倍TM、300倍TM；不同小写字母表示不同处理浓度同一时间差异显著(Plt;0.05)。下同。

Note:CK,1 000TM,800TM,500TM and 300TM denote CK and diluted 1 000,800,500 and 300 times,respectively.Different lower case letters indicate for the same immersion time significant difference among five treatments at 0.05 level.The same below.

杀菌剂浸泡浓度和时间对种子发芽率影响的双因素效应分析表明，甲基托布津和苯醚甲环唑两种杀菌剂的浓度、时间及交结效应对种子发芽率均有极显著的作用(Plt;0.01)(表1)。

图2 苯醚甲环唑(D)不同处理浓度和时间对中华羊茅种子发芽的影响Fig.2 Effects of different concentrations and time of difenoconazole on seed germination of Festuca sinensis

注：7 000D、6 000D、3 000D、1 000D分别表示稀释7 000倍D、6 000倍D、3 000倍D、1 000倍D的处理。下图同。

Note:7 000D,6 000D,3 000D and 1 000D are diluted 7 000、6 000、3 000 and 1 000 times,respectively.The same below.

表1 杀菌剂处理浓度和时间对中华羊茅种子发芽率影响的双因素方差分析Table 1 Two-way analysis of variance treated by difference concentration and time on seed germination of Festuca sinensis

2.2杀菌剂对种子萌发、幼苗带菌率及其生长的影响 种子处理及幼苗生长试验表明,甲基托布津和苯醚甲环唑两种杀菌剂均有显著的杀菌效果(Plt;0.05)，但对种子发芽率的影响差异较大。甲基托布津的300倍和500倍液浸泡8 h时对中华羊茅种子萌发没有显著影响，与对照相比，其种子发芽率无显著变化，分别为80%和78%。但300倍和500倍甲基托布津可使带菌率从98%分别降低到7%和10%。苯醚甲环唑1 000倍和3 000倍处理8 h可显著降低种子发芽率 ，从79%分别降低到54%和63%。而1 000倍和3 000倍苯醚甲环唑处理使带菌率由98%分别降低到5%和30%(图3)。

图3 不同浓度甲基托布津(TM)和苯醚甲环唑(D)处理8 h对中华羊茅种子的发芽率和幼苗带菌率的影响Fig.3 Effects of thiophanate-methyl and difenoconazole on seed germination and endophyte infection of Festuca sinensis

通过对少数仍然带菌幼苗体内内生真菌菌丝进一步测量发现，两种杀菌剂的4个浓度处理对幼苗体内菌丝生长影响较大。非杀菌剂处理的对照组菌丝密度最高，显著高于各处理组，其中以300TM组菌丝密度最低，其次为1 000D和500TM(图4A)。

与对照相比，甲基托布津300倍和500倍处理对中华羊茅株高无显著影响；而苯醚甲环唑1 000倍处理可显著降低中华羊茅株高，3 000倍处理则无显著影响(Pgt;0.05)(图4B)。两种杀菌剂的4个处理对中华羊茅植株分蘖没有显著影响。

图4 甲基托布津(TM)和苯醚甲环唑(D)杀菌剂处理对中华羊茅幼苗体内菌丝密度(A)和株高(B)的影响Fig.4 Effects of thiophanate-methyl (TM) and difenoconazole (D) treatments on mycelial density (A) and plant height (B) of Festuca sinensis seedling

3 讨论

本研究是我国学者首次探讨杀菌剂对禾草内生真菌的的杀菌作用，之前，李春杰和南志标[12]曾对醉马草(Achnatheruminebrians)-内生真菌共生体在不同温度和湿度处理下的生物学和生态学特性进行过探讨；但有关杀菌剂对禾草内生真菌杀菌作用的研究尚属首例。国际上Latch和Christensen[21]、Harvey等[22]和Gundel等[23]以内吸性杀菌剂对多年生黑麦草(Loliumperenne)内生真菌的杀菌作用进行了研究，均取得显著杀菌效果。

本研究以我国市售的甲基托布津和苯醚甲环唑两种常见的内吸杀菌剂为试验材料，其中，甲基托布津的作用机理主要是干扰真菌的有丝分裂中纺锤体的形成，影响细胞分裂，起到杀菌作用，性价比高，对人、畜、植物都很安全[24]；苯醚甲环唑的作用机理是通过抑制麦角甾醇的生物合成而干扰真菌的正常生长[25]。试验结果发现，300倍甲基托布津的处理使带菌率由98%降低到7%(图3)，对发芽率没有显著影响，此结果较理想。Latch和Christensen[21]用40%咪鲜胺乳油以0.25 g·kg-1的剂量处理多年生黑麦草种子，幼苗带菌率由90%降低到了15%，而种子发芽率仍高达92%。Harvey等[22]用40%的咪酰胺乳油以2.5 mL·kg-1处理多年生黑麦草种子，可以完全除去黑麦草内生真菌，但是种子发芽率由94%降到74%。Gundel等[23]采用15%的三唑醇可湿性粉剂以5 g·kg-1种子的剂量处理多花黑麦草(L.multiflorum)的种子可以使幼苗的带菌率由85%降低到5%。本试验中300倍甲基托布津处理相当于8 g·kg-1种子的剂量，3 000倍苯醚甲环唑处理相当于0.8 g·kg-1种子的剂量。甲基托布津处理浓度是苯醚甲环唑的10倍，也显著高于前人使用杀菌剂浓度，尽管苯醚甲环唑的使用浓度显著低于甲基托布津，但是对种子发芽率的抑制作用却显著高于甲基托布津，并且杀菌作用显著低于甲基托布津，可见不同的杀菌剂稀释浓度与处理效果之间存在差异。与国际内生真菌研究的结果相比，本研究所筛选的70%甲基托布津处理中华羊茅等禾草种子按照8 g·kg-1种子，即每千克种子5.6 g有效成分用量杀菌效果良好且不影响种子萌发和幼苗生长，此外70%甲基托布津通过部级鉴定是一种高效低毒、广谱内吸性杀菌剂，具有保护和治疗作用，广泛用于多种作物[26]，建议在生产中使用。

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EffectsoftwofungicidesonNeotyphodiumseed-bornefungalendophyteofFestucasinensis

YAO Xiang1, LI Xiu-zhang1, ZHU Xiao-xiao2, LI Chun-jie1

(1.The State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems; College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China；2.Lanzhou Five-spring Park, Lanzhou 730030, China)

Festucasinensis, a good quality and cold tolerant forage in alpine region of China, was studied to explore the effect of two systemic fungicides on fungal endophyte ofF.sinensisat different concentrations and times. Thiophanate-methyl (TM) and difenoconazole (D) had five concentrations and four distinct times respectively. The result of germination experiment indicated that 8 h was the most reasonable. Meanwhile, 500, 300-fold dilution TM and 3000, 1 000-fold dilution D were considered to be effective treatments for a next experiment with the 8 h. The result revealed that the order of endophyte infection of seedling was: 3 000 Dgt;500 TMgt;300 TMgt;1 000 D; the order of germination rate of seedling was: 300 TMgt;500 TMgt;3 000 Dgt;1 000 D. The sterilization of 300 and 500-fold dilution TM was significant (Plt;0.05) and had no adverse effect on germination rate，endophyte infection of seedling was reduced from 98% to 7% and 10%. The 8 h treatment of 1 000 and 3 000-fold dilution D reduced germination rate significantly (Plt;0.05) from 79% to 54% and 63%, and at the same time, endophyte infection was reduced significantly (Plt;0.05) from 98% to 5% and 30%. Therefore, the solution of 300-500-fold dilution thiophanate-methyl treated seeds in 8 h was the best way to eliminate fungal endophyte ofF.sinensis.

fungal endophyte;Festucasinensis; systemic fungicide; germination rate; infectious rate

LI Chun-jie E-mail:chunjie@lzu.edu.cn

S432.4+4;S482.2

A

1001-0629(2013)10-1517-06

2012-11-21 接受日期：2012-12-17

国家973项目(2014CB138700)；国家自然科学基金项目(31372366)；教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET-08-0256)；兰州市科技攻关项目(2008-SY-12)；兰州大学高校基本科研业务费重点项目(lzujbky-2012-k01)作者简介:姚祥(1988-)，男，安徽蚌埠人，在读硕士生，主要从事禾草内生真菌共生体研究。E-mail:bbyaoxiang@qq.com

李春杰(1968-)，男，甘肃镇原人，教授，博士，主要从事禾草内生真菌共生体研究。E-mail:chunjie@lzu.edu.cn