亚硝态氮胁迫对日本蟳消化酶活力及同工酶表达的影响

许星鸿,张雁秋,阎斌伦,刘艳晴,陈 松,黄福林,唐 瑶 (1.中国矿业大学环境与测绘学院,江苏 徐州 1008；.淮海工学院海洋学院,江苏 连云港 005)

亚硝态氮是氨氧化成硝态氮的中间产物,是反映水质状况的重要指标之一[1].在集约化养殖系统中,由于养殖密度和投饵量的加大,积累的残饵,代谢废物等有机物往往造成养殖水体中亚硝态氮浓度的升高,严重影响养殖对象的生理代谢功能[2-3].日本蟳(Charybdis japonica)广泛分布于我国各海区,为经济价值较高的海产蟹类[4].许星鸿等[5]就亚硝态氮胁迫对日本蟳免疫相关指标的影响进行了研究,但迄今尚未见有关亚硝态氮胁迫对日本蟳消化酶和同工酶影响的报道.消化酶活力的高低直接反映了机体对营养物质消化吸收的能力,进而影响到机体的存活与生长,而同工酶是生物体代谢的调节者,可以呈现机体代谢的一些变化.本文研究了亚硝态氮胁迫下,日本蟳肝胰腺消化酶活力的变化规律以及对同工酶表达的影响,旨在探讨亚硝态氮对日本蟳的毒性作用,为人工养殖的水质调控及相关毒理学研究提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料

日本蟳于2011年11月购自连云港市赣榆县海滨,采用生态闭路循环养殖系统暂养 7d,盐度25,pH8.0,水温 15℃,自然光照,连续充气,一日投喂2次鲜活贝类.选择附肢完整,活力强且大小相近者用于实验.甲长为(5.85±0.51)cm,甲宽为(7.69±0.62)cm,体质量为(94.22±22.37)g.

1.2 实验梯度设置

亚硝态氮源为亚硝酸钠,为国产分析纯.根据预实验所得亚硝酸钠对日本蟳的半致死浓度(96h-LC50为75.34mg/L)以及养殖水体通常的亚硝态氮污染浓度[3],亚硝酸钠浓度设 7组:对照组(0mg/L),0.15,0.3,2,5,10,20mg/L,每组设 3 个平行,每个平行随机取22只蟹,饲养7d.水温,投饵,充气等养殖条件与暂养时相同.每日定时换水2次,并维持各组亚硝酸钠质量浓度.于实验0,0.5,1,3, 5,7d,每个平行随机取 3只蟹,置冰盘内解剖,取出肝胰腺,保存于-80℃待测消化酶活力.于实验第7d,分别取对照组和高浓度(20mg/L)组的鳃,肌肉,肝胰腺,胃,心脏,卵巢,精巢等组织,-80℃保存备用于同工酶实验.

1.3 样品制备

取上述样品,以1:5(W/V)加入0.1mol/L预冷磷酸盐缓冲液(pH7.0),冰浴研磨匀浆 5min,取部分肝胰腺匀浆液直接用于测定脂肪酶活力,其余匀浆液用高速冷冻离心机(0～1℃)以 10000r/min的转速离心 30min,取上清液用于其他消化酶或同工酶检测.

1.4 检测方法

蛋白酶活力测定采用福林－酚法[6],淀粉酶和纤维素酶活力测定分别采用淀粉－碘显色法和 3,5-二硝基水杨酸(DNS)显色法[7],脂肪酶活力测定采用 NaOH滴定法[8].样品蛋白含量采用南京建成生化试剂盒测定.

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行同工酶检测,浓缩胶浓度为 4%,分离胶浓度为 10%,样品在浓缩胶中时的电压为 80V,进入分离胶后电压调整为 120V,4℃下电泳.同工酶显色方法参照毛盛贤[9]的方法.

1.5 数据分析

酶活力数据以“平均数±标准差”表示,采用SPSS16.0软件进行统计分析,进行单因子方差分析(One-Way ANOVA),LSD(Least Significant Difference)多重比较和Duncan检验.显著水平设为0.05.显色固定后的凝胶用美国伯乐ChemDoc XRS型凝胶成像系统进行拍照,本文所有电泳图谱上方为阴极,下方为阳极,各酶谱的酶带根据其相对迁移率Rf由大到小编号,即自阳极方向的酶带开始依次编号为1,2,3…….

2 结果

2.1 亚硝态氮胁迫对日本蟳肝胰腺消化酶活力的影响

2.1.1 亚硝态氮胁迫对日本蟳肝胰腺酸性蛋白酶活力的影响 由表 1可见,亚硝态氮胁迫对日本蟳肝胰腺酸性蛋白酶活力的影响基本表现为“先诱导后抑制”.在处理0.5d时,除20mg/L组外,其他实验组酸性蛋白酶活力均受到不同程度的诱导,以5mg/L组诱导程度最为显著.随着胁迫时间的延长,0.15和0.3mg/L两组酸性蛋白酶活力于第5d升至最高,2mg/L组酸性蛋白酶活力最大值出现于第3d,而胁迫浓度5mg/L及以上的处理组酸性蛋白酶活力均在胁迫第1d升至最高,随后出现下降.至处理 7d时,高浓度(10,20mg/L)处理组酸性蛋白酶活力显著低于对照组(P＜0.05).

观察特定时间的效应-剂量关系,可发现处理0.5d时,胁迫浓度5mg/L以下的处理组酸性蛋白酶活力与剂量浓度之间存在正相关关系(r=0.913, P＜0.05).处理7d时,胁迫浓度2mg/L及以上的处理组酸性蛋白酶活力与剂量浓度之间则呈现负相关关系(r=-0.972,P＜0.05).

表1 亚硝态氮胁迫对日本蟳肝胰腺酸性蛋白酶活力(U/mg蛋白)的影响Table 1 Effect of nitrite stress on acid protease activity(U/ mg pro.)of hepatopancreas in Charybdis japonica

2.1.2 亚硝态氮胁迫对日本蟳肝胰腺碱性蛋白酶活力的影响 从表 2可看出,在亚硝态氮胁迫下,碱性蛋白酶活力在不同的剂量浓度下表现出不同的变化规律:在5mg/L及以下的处理组,碱性蛋白酶活力表现为“先诱导后抑制”,诱导程度以0.3mg/L组最为显著;10mg/L组碱性蛋白酶活力表现为“先抑制后诱导再抑制”;而 20mg/L组碱性蛋白酶活力在处理 0.5d时,受抑制程度较大,虽然在处理1d时有小幅回升,但随后呈持续下降趋势.至处理7d时,胁迫浓度5mg/L及以上的处理组碱性蛋白酶活力低于对照组(P＜0.05).

观察某一时间的效应-剂量关系,0.3mg/L及以上的实验组在处理第5d和第7d时,碱性蛋白酶活力与剂量浓度间均呈显著负相关关系(P＜0.01).

表2 亚硝态氮胁迫对日本蟳肝胰腺碱性蛋白酶活力(U/mg 蛋白)的影响Table 2 Effect of nitrite stress on alkali protease activity(U/ mg pro.)of hepatopancreas in Charybdis japonica

2.1.3 亚硝态氮胁迫对日本蟳肝胰腺脂肪酶活力的影响 由表3可知,在亚硝态氮胁迫下,各实验组脂肪酶活力均呈现“先诱导后抑制”的变化规律,诱导程度以10mg/L组最大,在0.5d时,其脂肪酶活力升高至对照组的1.4倍.5mg/L及以下的实验组脂肪酶活力于胁迫 1d时升至最大,而10,20mg/L两组最高值出现于处理 0.5d,随后呈下降趋势.至处理7d时,2mg/L及以下的实验组脂肪酶活力高于对照组,而 10,20mg/L两组脂肪酶活力显著低于对照组(P＜0.05).

在亚硝态氮胁迫对脂肪酶的效应与剂量关系方面,浓度10mg/L以下的短期胁迫(0.5d和1d)下,脂肪酶活力与剂量浓度间呈正相关关系,相关系数分别为:r=0.946(P＜0.01)和 r=0.831(P＜0.05).而胁迫浓度2mg/L及以上的实验组在处理第5d和第7d时,碱性蛋白酶活力与剂量浓度间均呈显著负相关关系,相关系数分别为:r=-0.957(P＜ 0.05)和r=-0.993(P＜0.01).

表3 亚硝态氮胁迫对日本蟳肝胰腺脂肪酶活力(×10-3U/mg蛋白)的影响Table 3 Effect of nitrite stress on lipase activity of hepatopancreas(×10-3U/ mg pro.)in Charybdis japonica

2.1.4 亚硝态氮胁迫对日本蟳肝胰腺淀粉酶活力的影响 亚硝态氮胁迫对日本蟳肝胰腺淀粉酶活力的影响基本上表现为抑制(表4).2mg/L及以上的实验组淀粉酶活力持续下降,于处理5d后趋于平稳,显著低于对照组(P＜0.05).

在实验期间,淀粉酶活力与剂量浓度间均呈显著负相关关系(P＜0.01).

2.2 亚硝态氮胁迫对日本蟳同工酶的影响

表4 亚硝态氮胁迫对日本蟳肝胰腺淀粉酶活力的影响(U/mg 蛋白)Table 4 Effect of nitrite stress on amylase activity of hepatopancreas(U/ mg pro.)in Charybdis japonica

2.2.1 亚硝态氮胁迫对日本蟳 α-淀粉酶 α-AMY同工酶的影响 如图 1所示,在对照组中,α-AMY 同工酶在鳃中显示出 3条酶带:α-AMY-1,α-AMY-2 和 α-AMY-3;在肝胰腺中显示出2条酶带:α-AMY-1和α-AMY-2;而在肌肉,卵和胃中仅表达出α-AMY-1活性.3条酶带活性强弱依次为:α-AMY-1＞α-AMY-2＞α-AMY-3,α-AMY-1在不同组织中的表达活性依次为:肝胰腺＞胃＞肌肉＞卵＞鳃.在亚硝态氮胁迫下,各处理组 α-AMY活性均有所下降,其中鳃处理组仅表达1条酶带α-AMY-1,肝胰腺处理组酶带数量未减少,但活性减弱.

2.2.2 亚硝态氮胁迫对日本蟳乳酸脱氢酶LDH同工酶的影响 LDH同工酶在日本蟳肌肉,卵子,精子和心脏中均表达出1条酶带(图2),酶带活性强弱依次为:肌肉＞精子＞心脏＞卵.在亚硝态氮胁迫下,各处理组 LDH 表达均有所减弱,以卵处理组LDH活性最低.

2.2.3 亚硝态氮胁迫对日本蟳苹果酸脱氢酶MDH同工酶的影响 由图3可见,MDH同工酶共表达出7条酶带,其中MDH-1,MDH-4和MDH-7在肌肉,卵,精子,鳃和心脏中均有表达,而 MDH-2,MDH-3,MDH-5和MDH-6的表达表现出明显的组织特异性:MDH-2在鳃中不表达;在卵和精子中表达MDH-3,但未表达 MDH-5;MDH-6仅在鳃中有微弱表达.在亚硝态氮胁迫下,肌肉处理组 MDH-1活性有所下降,MDH-5和MDH-7两条酶带消失,但新增两条酶带:MDH-2和MDH-4,且活性较强;鳃处理组MDH-1活性比对照组略强;其他各处理组MDH同工酶均出现活性下降甚至酶带消失现象.

图1 亚硝态氮胁迫对日本蟳淀粉酶α-AMY同工酶的影响Fig.1 Effect of nitrite stress onα-amylase isozymes of Charybdis japonica

图2 亚硝态氮胁迫对日本蟳乳酸脱氢酶LDH同工酶的影响Fig.2 Effect of nitrite stress on lactate dehydrogenase isozymes of Charybdis japonica

图3 亚硝态氮胁迫对日本蟳苹果酸脱氢酶MDH同工酶的影响Fig. 3 Effect of nitrite stress on malic dehydrogenase isozymes of Charybdis japonica

2.2.4 亚硝态氮胁迫对日本蟳过氧化物酶POD同工酶的影响 从图4可看出,对照组POD同工酶的表达表现出明显的组织特异性:肌肉和鳃均表达 POD-4和 POD-6;肝胰腺表达 POD-5和POD-6;心脏表达 4条酶带:POD-2,POD-3,POD-4和POD-6;除POD-4以外的5种POD同工酶在卵中均有表达.在本实验高浓度(20mg/L)亚硝态氮胁迫 7d后,除肝胰腺处理组的 POD-6有微弱表达外,其他各处理组均未检测到POD同工酶活性.

图4 亚硝态氮胁迫对日本蟳过氧化物酶POD同工酶的影响Fig.4 Effect of nitrite stress on peroxidase isozymes of Charybdis japonica

3 讨论

3.1 环境胁迫对甲壳动物消化酶活力的影响

甲壳动物消化酶活力是反映其消化生理机能的重要指标,环境因素能通过改变消化酶活力而影响到机体的生长甚至生存.王维娜等[10]报道水体中适量的金属离子可激活日本沼虾(Macrobrachium nipponense)消化道中胃蛋白酶和类胰蛋白酶的活性,高浓度时则有抑制作用.徐武杰等[11]研究表明三疣梭子蟹(Portunus trituverculatus)在氨氮(1,5,20mg/L)胁迫下消化酶活力呈现明显的峰值变化,至24h和48h时趋于稳定,肝胰腺胃蛋白酶和脂肪酶活力与氨氮胁迫浓度呈正相关,而淀粉酶活力与剂量浓度呈明显负相关.Antoine等[12]研究发现欧洲海鲈(Dicentrarchus labrax)在浓度为 0.53～16.11mg/L的氨氮慢性胁迫下饲料转化率随着氨氮浓度升高而升高.本实验中,较低浓度(≤10mg/L)的亚硝态氮胁迫对日本蟳肝胰腺消化酶活力产生一定的诱导效应,而高浓度(20mg/L)的亚硝态氮胁迫对碱性蛋白酶和淀粉酶活力表现出明显的抑制效应,与上述环境胁迫对甲壳动物消化酶活力的影响规律相近.

研究表明环境胁迫会导致甲壳动物产生应激反应,生理代谢发生较大的变化,如耗氧量增大,能量需求增加以及免疫相关酶活力升高等[13-14].Stebbing[15]把这种在毒物作用下生物酶出现的增益现象称为“毒物兴奋效应”.一定浓度亚硝态氮胁迫下,日本蟳消化酶活力的升高可提高机体对饵料的消化能力,利于补偿因应激反应所增加的能量消耗.但是当亚硝态氮超过一定的阈值或者长期处于胁迫条件下,日本蟳的溶菌酶等免疫酶活力会出现显著下降[16].在本实验中处理 7d时,胁迫浓度2mg/L及以上的实验组各消化酶活力与剂量浓度间均呈明显负相关,表明亚硝态氮的过度胁迫会显著影响到机体的消化功能.

3.2 环境胁迫对甲壳动物同工酶表达的影响

同工酶是广泛存在于生物体同一种属或同一生物不同组织器官,由不同基因位点或等位基因编码的多肽链的单体,纯聚体或杂聚体,能催化相同化学反应,但其理化或生物性质不同的酶,可作为基因表达的分析工具[9].本实验中日本蟳不同组织的α-AMY,LDH,MDH和POD等4种同工酶的表达均表现出明显的组织特异性,与宋微微等[17]的研究结果相一致,其中关于日本蟳POD同工酶的表达分析属首次报道.

王兰等[18-19]报道高浓度的镉胁迫对河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)POD同工酶以及中华绒螯蟹(Eriocheir siensises)酯酶EST同工酶均表现出明显的抑制作用.俞亚东等[20]研究发现高浓度的铜和锌都会导致罗氏沼虾鳃中超氧化物歧化酶 SOD条带变窄,颜色变淡.本实验中,高浓度亚硝态氮的胁迫对日本蟳的α-AMY,LDH, MDH和POD等同工酶表达均表现出一定的抑制作用.LDH与运动供能相关,MDH是三羧酸循环中催化苹果酸和草酰乙酸相互转变的酶,其含量能影响糖的有氧氧化反应的进行及ATP的合成[17].而POD是抗氧化功能酶,能催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应,可与SOD协同作用清除生物体在逆境胁迫下产生的大量自由基[21].α-AMY,LDH,MDH和 POD等同工酶的活性降低表明机体的消化,能量代谢及抗氧化功能等均受到影响.高浓度亚硝态氮胁迫下,日本蟳肌肉中新增两条活性较强的酶带(MDH-2和MDH-4)可能与机体处于逆境中能量消耗大,代谢负荷加重有关.关于较低程度的环境胁迫对日本蟳同工酶表达的影响尚需进一步研究.

国家渔业水质标准中未对亚硝态氮浓度有明确要求,但一些地方标准提出了水质中亚硝态氮的上限浓度,如舟山市海洋与渔业局水质标准中规定亚硝酸钠浓度≤0.3mg/L,而崇明农业网推荐养殖水体亚硝酸盐浓度以≤0.15mg/L为宜.本研究表明,日本蟳在 0.15,0.3mg/L的亚硝态氮胁迫 7d后,消化酶活力基本上无显著变化,表明低浓度的亚硝态氮胁迫对日本蟳消化功能未造成明显影响.浓度在2mg/L及以上的亚硝态氮胁迫导致日本蟳消化酶的活力显著降低,20mg/L的高浓度亚硝态氮胁迫可造成日本蟳同工酶表达的活性减弱,表明亚硝态氮的过度胁迫会显著影响机体的消化,能量代谢及免疫等功能,可能会导致疾病暴发,这在养殖生产中值得注意.

4 结语

日本蟳消化酶活力可被低浓度(0.15,0.3mg/L)的亚硝态氮胁迫所诱导,且在处理7d时,仍保持在较高的水平;较高浓度(2,5,10mg/L)亚硝态氮的短期胁迫(0.5～1d)会诱导酸性蛋白酶,碱性蛋白酶和脂肪酶活力的迅速升高后又快速下降;而高浓度(20mg/L)的亚硝态氮胁迫显著抑制日本蟳消化酶活力和同工酶表达.

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