利用F0F1-ATPase分子马达技术检测志贺氏菌*

张捷，王燕飞，王璇，王小晋，顾德周，张惠媛，尚士进，王娟，汪琦，王佩荣，陈广全，乐加昌

1(北京出入境检验检疫局，北京，100026)

2(中国检验检疫科学研究院，北京，100123)

3(中国中医科学院望京医院检验科，北京，100102)

4(淮安出入境检验检疫局，江苏淮安，223001)

5(中国科学院生物物理研究所，北京，100101)

利用F0F1-ATPase分子马达技术检测志贺氏菌*

张捷1，王燕飞2，王璇3，王小晋4，顾德周1，张惠媛1，尚士进1，王娟1，汪琦1，王佩荣5，陈广全1，乐加昌5

1(北京出入境检验检疫局，北京，100026)

2(中国检验检疫科学研究院，北京，100123)

3(中国中医科学院望京医院检验科，北京，100102)

4(淮安出入境检验检疫局，江苏淮安，223001)

5(中国科学院生物物理研究所，北京，100101)

利用载色体chromatophore上的F0F1-ATPase分子马达生物传感器，建立应用在食品检测中快速检测方法。首先从嗜热菌中提取载色体，合成生物素化宋内氏志贺氏菌IpaH探针，在载色体ATP合酶的ε亚基上连接ε亚基抗体－生物素－链霉亲和素－生物素－IpaH探针，将待测宋内氏志贺氏菌标准菌株和阴性对照分别与此生物传感器结合，比较其催化ATP合成10 min后的ATP产生量，进而对宋内氏志贺氏菌DNA进行检测。ATP合成的量可以通过luciferase-luciferin检测试剂所体现的荧光强度大小标定。结果表明，chroIpaH(连接在载色体chro上的IpaH探针)的浓度在0.031 mg/mL，宋内氏志贺氏菌DNA浓度在50 ng/mL为最适检测条件。通过与实际检测样品的传统检测方法及PCR检测方法对照，具有良好的检测符合性。

F0F1-ATPase分子马达，宋内氏志贺氏菌，IpaH探针，快速检测

近年来世界范围内食品安全恶性事件屡有发生，动物源性食品食源性致病菌发生率高居不下，对这些致病菌的快速检测一直是国内外关注的焦点。志贺氏菌(Shigella spp.)通称痢疾杆菌，是一类具有高度传染性的肠道致病菌。志贺氏菌主要通过消化道途径传播，侵袭肠上皮细胞，引起以发热、腹痛、腹泻为特征的典型的痢疾症状，严重危害人类健康［1］。据统计，每年有1.647亿人感染痢疾，1.1万人死亡，其中多数为5岁以下的儿童［2］。在成年患者中，10～100CFU志贺氏菌就可通过感染肠道致病，引发严重的炎症反应［3］。我国食品安全法规定宋内氏志贺氏菌在食品中不能检出。目前，包括我国在内的许多国家对宋内氏志贺氏菌的检测普遍采取传统检测方法，报告检测结果大致需要4～5d，加之检测方法繁琐，费时费力，不仅成为检验部门的一项沉重负担，而且也不能满足日益发展的国际贸易的需要［4］。本研究采用高灵敏生物传感器F0F1-ATPase分子马达技术对动物源性食品中的宋内氏志贺氏菌进行检测，大大缩短了检测时间。F0F1-ATPase是一种旋转分子马达，它既能利用跨膜H+梯度合成ATP，又能水解ATP而反向运转H+。F0F1-ATPase普遍存在于动物线粒体的内膜、植物叶绿体的类囊体膜和细菌的质膜上，其主要功能是在生物体系中参与氧化磷酸化或光合磷酸化，催化合成ATP。［5］本研究所用到的载色体即存在于嗜热菌中的质膜。在ATP合成过程中，质子能够从色素体膜内泵到膜外侧，导致内膜微环境溶液H+浓度变化。研究发现，在F0F1-ATPase上连接负载会不同程度影响其旋转性能，在其ε亚基上连接上特异性探针能引起ATP合成速率的改变［6，7］。而且luciferase-luciferin发光强度与ATP浓度呈线性关系。基于上述两个理论，本研究在ATP酶上负载目标检测物(DNA)，以luciferase-luciferin检测试剂的荧光强度作为信号反应负载程度，以达到检测目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

宋内氏志贺氏菌51334，鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、副溶血性弧菌 ATCC 17802、霍乱弧菌 ATCC 14035、大肠杆菌 ATCC 25922、阪崎肠杆菌 ATCC 29544，上述标准菌株购自美国典型菌种保藏中心。

1.1.2 试剂

志贺氏菌增肉汤-新生霉素缓冲蛋白胨水、麦康凯(MAC)琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐(XLD)琼脂，北京陆桥技术有限责任公司;PBS缓冲液(实验室自制)、合成缓冲液(实验室自制)、生物素(Biotin-AC5-Sulfo-Osu)为日本Dojindo公司产品;链球菌抗生物蛋白(Streptavidin)，sigma公司产品;荧光素酶(Promega)、超纯水(实验室自制)、DNA提取试剂盒(离心柱型)DP320，天根公司;其他试剂为国产分析纯。

1.1.3 仪器与设备

恒温培养箱、超速冷冻离心机，HITACHI公司，CP100MX;恒温摇床，江苏太仓实验仪器设备厂;F4500荧光光谱仪，日立;超纯水仪，Thermo;化学发光检测仪，Promega;高压灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌的培养及DNA的提取

宋内氏志贺氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、阪崎肠杆菌的标准菌株均按照国家食品卫生微生物学检验标准进行增菌及选择性培养，最后获得的菌体用于DNA的提取。食品中宋内氏志贺氏菌的检测方法按照国家标准GB4789.5－2012《食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验》进行检测，从阳性样品中得到的菌株按上述方法进行富集培养，获得菌体用于DNA的提取。

将培养获得宋内氏志贺氏菌用DNA提取试剂盒(离心柱型)DP320进行提取，详细操作步骤见试剂盒说明书。获得的菌体的DNA提取液用作PCR扩增时的模板以及分子马达传感器的目标检测物。该DNA提取液置于冰箱中－20℃保存，使用时置于室温自然解冻，然后用振荡器振荡混匀。

1.2.2 载色体的制备

将嗜热菌菌种按比例1∶100接种到液体培养基，60 ℃ 150 r/min，培养 24 h。然后 4 000 r/min，30 min，4℃离心收集菌体。用提取缓冲液(20 mmol/L Tris-Cl pH8.0，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT)重悬菌体，离心去上清液(6 000 r/min，10 min，4℃)。加入提取缓冲液重悬菌体(约1 g加入10 mL缓冲液)，再加入终浓度1 mmol/L PMSF，冰上超声破碎30 min(超声5 s，停8 s)。将破碎菌体离心(6 000 r/min，30 min，4℃)，去沉淀取上清液。将上清超速离心(40 000 r/min，1 h，4 ℃)，取沉淀即为载色体。最后用提取缓冲液重悬沉淀并加入终浓度50%的甘油－80℃保存。

1.2.3 探针的合成及F0F1-ATPase分子马达生物传感器的构建

通过文献及标准的查找，确定将宋内氏志贺氏菌特异性基因IpaH作为目的基因片段，选取IpaH基因上游5’保守序列ATTCCGTGAACAGGTCGCTGCATGGCTC合成核酸探针，其中5’用生物素进行标记，此探针由上海吉玛制药技术有限公司合成。另外合成5’-TCCGATACCGTCTCTGCACGCAAT-3’ 和 5’-AGCGAAAGACTGTCGAAGCTC-3’用于PCR验证。

取出200 μL载色体于1.5 mL EP管中，再向管中加入40 μL N-生物素标记 ε亚基抗体，用 PBS补加至1 mL，37℃反应1 h;用 PBS补加至1.4 mL，4℃ 30 000 r/min超速离心10 min;弃上清液，将沉淀用500 μL PBS重悬;加入链球菌抗生物蛋白(2 mg/mL)2 μL，用 PBS补加至1 mL，室温摇床上(转速50～100 r/min)反应10 min;用 PBS补加至1.4 mL，4℃ 30 000 r/min超速离心10 min，弃上清液，将沉淀用500 μL PBS重悬加入N-生物素标记的核酸探针(10 μmol/L)50 μL，用 PBS 补加至1 mL，室温摇床上(转速50～100 r/min)反应10 min;每管用PBS补加至1.4 mL，4℃ 30000 r/min超速离心10 min，弃上清液，沉淀即为chroIpaH，然后用150 μL含30%甘油的PBS重悬载色体，在管壁上标明制作日期、连接体系、制作人等信息，放入－20℃冰箱备用。

图1 分子马达传感器模式图Fig.1 The model of molecular motor sensor

1.2.4 F0F1-ATPase分子马达检测体系的构建

取1.5mL EP管，加入待检测的DNA溶液10 μL。将上述EP管置于95℃水浴5 min，然后再置于50 ℃水浴 1 min。［8］取 2 μL chroIpaH，用合成缓冲液稀释到一定的倍数。取稀释后的chro 10 μL加入EP管。另取1个EP管加入10 μL H2O，置于95℃水浴5 min，然后转入50℃水浴1 min，再加入10 μL合成缓冲液作为本底对照，短暂振荡使反应液混匀。再向2管中分别加入30μL启动缓冲液(启动缓冲液由ADP(1.3 mol/L)和合成缓冲液按体积比1∶3配制，每次实验按需要取一定的量配制，现用现配)，振荡使反应液混匀，然后立即短暂离心使管壁上的液滴流下。将上述反应体系放入37℃恒温摇床中温育10min，启动反应。将EP管从摇床中取出，分别加入200 μL PBS缓冲液，振荡使体系混匀。取一块干净的96孔板，将2管中的最终反应体系加入其中，每个体系加3孔，每孔加样50 μL，然后对每个加样孔分别加入30 μL的荧光素酶溶液，用移液枪反复吹打几次使溶液混匀。将96孔板上化学发光检测仪检测，读取数据，对各组数据取平均值，然后用样本数值减去本底数值即为样本的实际荧光值。

2 结果与讨论

2.1 ChroIpaH特异性实验

本实验用ChroIpaH区分不同的菌种，以实现对宋内氏志贺氏菌的检测，不包括对宋内氏志贺氏菌不同的亚属的区分。用ChroIpaH检测宋内氏志贺氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌及阪崎肠杆菌的DNA。测得ChroIpaH的初始浓度为1.558 mg/mL，本试验在ChroIpaH浓度为0.031 mg/mL，DNA 浓度为50 ng/mL，37℃下启动10 min，检测反应终体系的荧光值，结果见图2。

图2 ChroIpaH对宋内氏志贺氏菌的特异性检测结果Fig.2 Results of specificity of ChroIpaH on Shigellasonnei

由图2的数据可以看出，ChroIpaH对宋内氏志贺氏菌具有良好的特异性，能够区分不同种属。

2.2 F0F1-ATPase分子马达检测技术与传统检测方法及PCR法检测结果对比

在与传统检测方法及PCR法检测结果进行对比时，进行了ChroIpaH浓度与宋内氏志贺氏菌DNA浓度在F0F1-ATPase分子马达检测的最适条件实验，试验结果表明ChroIpaH浓度为0.031 mg/mL，宋内氏志贺氏菌DNA浓度为50 ng/mL时最终体系的荧光值强度差值百分比最大，即检测效果最佳。在利用F0F1-ATPase分子马达检测技术与传统检测方法及PCR法检测结果对比时，选取ChroIpaH浓度为0.031 mg/mL下，对2株标准菌株DNA浓度为50 ng/mL下进行检测，结果为阳性菌株。图3显示了通过PCR对2株标准菌株的IpaH基因进行扩增的电泳结果。表1显示了F0F1-ATPase分子马达检测法与国标检测方法及PCR法检测结果的对照，其具有良好检出效果。

图3 2株标准菌株DNA PCR扩增IpaH基因电泳图Fig.3 PCR amplification of IpaH gene electrophoresis of 2 standard strains’DNA

表1 不同检测方法结果比较Table 1 Result comparision of different detection methods

3 结论

传统的宋内氏志贺氏菌检测方法要求对样品进行非选择性增菌、选择性增菌、分离、筛选和鉴定等步骤，一般需要4～5 d才能出具检测报告，严重影响了动物源性食品的保鲜及货架寿命及食品进出口贸易。本研究表明，F0F1-ATPase分子马达生物传感技术对宋内氏志贺氏菌DNA的检测最适浓度为50 ng/mL，该方法能够满足一般食品微生物检测要求。利用该方法进行食品中宋内氏志贺氏菌检测，由于减少了传统生化鉴定检测、PCR法等方法中的菌种富集、选择性培养等步骤，而这一过程至少需要3 d，所以大大缩短了检测时间，并最终将检测时间控制在了2 d之内。通过对2株标准菌株进行传统方法、PCR法及F0F1-ATPase分子马达生物传感器检测的对比结果显示，结果的符合性为100%。该项技术还为宋内氏志贺氏菌的分子分型的研究奠定了基础，为水生食品的宋内氏志贺氏菌的溯源提供了技术支持。

由于该实验采用的是液相法，即参与反应的试剂和样品均在液相体系中进行，所以当样品不纯或含有杂质时，会影响结果的判断，因此，还可以将F0F1-ATPase分子马达生物传感器固定在膜上，以达到滤掉杂质，减少干扰的目的［9］。

F0F1-ATPase分子马达生物传感器具有良好的特异性、高灵敏度以及检测时间短等优点，不仅在临床诊断、心脑血管病的治疗、工业控制、环境保护以及生物技术、生物芯片等研究领域有着广泛的应用价值，而且对我国出入境食源性致病菌、病毒的快速、高通量检测以及分型方面将有着更加广泛的应用前景。

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The study of a detecting technology for Shigellabased on F0F1-ATPase molecular motor biosensor

Zhang Jie1，Wang Yan-fei2，Wang Xuan3，Wang Xiao-jin4，Gu De-zhou1，Zhang Hui-yuan1，Shang Shi-jin1，Wang Juan1，Wang Qi1，Wang Pei-rong5，Chen Guang-quan1，Yue Jia-chang5
1(Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China)
2(Chinese Academy of inspection and quarantine，Beijing 100123，China)
3(Wangjing Hospita of China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100102，China)
4(Huai an Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Huai an 223001，China)
5(Institute of Biophysics Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China)

The core technology is the use of chromatophore on the F0F1-ATPase molecular motor biosensor for rapid detection of Shigellasonnei in the food.Specific IpaHprobe were connected with F0F1-ATPase’s ε subunit using avidin-biotin system，and then biosensors were constructed，the test samples and negative sample，respectively，were combined with biosensors，to compare their catalytic ATP synthesis after 10 min.Shigellasonnei DNA in the samples could be tested.The amount of ATP synthesis could be detected by measuring the amount of H+，while the amount of H+could be indicated by fluorescence intensity through luciferase-luciferin assay.The results of our experiments showed that optimum conditions for detection were the concentration of chroIpaH was 0.031 mg/mL and the concentration of Shigellasonnei DNA was 40 ng/mL.Results from the detection of actual samples were in good agreement with those from traditional detection methods and PCR detection method.

F0F1-ATPase molecular motor，Shigellasonnei，IpaHprobe，rapid detection

博士，高级工程师(王燕飞、王璇与第一作者同等贡献)。

*国家质检总局科技计划项目(No.2012IK146);北京市科委阶梯计划工作项目资助

2013－03－04，改回日期:2013－06－07