一株土壤源高产纤维素酶芽孢杆菌的分离与鉴定

董鹤娟，丁 轲*，恒子钤，贾艳艳，彭春平，罗伟光，李 旺

(1.河南省动物疫病与公共安全院士工作站，河南 洛阳 471003；2.河南科技大学 宏翔发酵饲料实验室，河南 洛阳 471003;3.河南省高等学校环境与畜产品安全重点学科开放实验室，河南 洛阳 471003)

我国是粮食大国，纤维素资源极为丰富，每年仅农作物秸秆产量就高达7×108t，约占世界20%[1-2]。但秸杆中纤维素较难降解，所以目前秸杆仅有极少部分用于反刍动物饲料，绝大多数都被燃烧，不仅造成了资源的浪费，而：还会带来环境污染[3-4]。将秸杆中的纤维素降解成畜禽可利用的多糖、蛋白质或其他营养成分的研究，已成为当务之急。目前最可能利用的手段就是筛选高效纤维素酶分解菌，但秸杆纤维素的降解不是单一菌种能够解决的，因为秸杆的降解需要β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等多种纤维素酶共同参与才能完成[4]。已有的研究主要集中在真菌方面，如里氏木霉、绿色木霉、白腐菌、米曲霉等[5-7]，对细菌方面研究的较少。但真菌存在活性不稳定和生物安全隐患等问题，而芽孢杆菌具有产酶能力强，耐高温、强酸，环境适应能力强等特点，所以很适宜作为秸杆发酵用菌种。本研究拟从自然界中分离筛选高产纤维素酶的芽孢杆菌，为研究秸杆的生物降解提供了基础材料。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样 品 分别取自河南省洛阳、商丘、周口、漯河等8个地市周围的秸杆、稻草垛下层5～10 cm的土壤58份。

1.1.2 培养基 (1)羧甲基纤维素钠(CMC)刚果红分离培养基：牛肉膏0.5%，氯化钠0.5%，琼脂粉1.5%，CMC 1%，调pH 7.0～7.2，121 ℃，高压灭菌20 min，每100 mL培养基加入3 mL 0.5%刚果红;(2) 种子培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，氯化钠0.5%，调pH 7.0～7.2；(3) 发酵培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，氯化钠0.5%，CMC 1%，调pH 7.0～7.2。

1.1.3 主要试剂的配制 3，5-二硝基水杨酸试剂配制：称取200 g酒石酸钾钠，溶于一定量水中，加热溶解，添加3,5-二硝基水杨酸10.0 g、氢氧化钠10.0 g，溶解后加入苯酚2.0 g、无水亚硫酸钠0.5 g，全部加热溶解后，冷却至室温，定容至1 000 mL。用前一周配制。

1.2 方 法

1.2.1 样品的处理 取适量的样品于试管中，分别加入5 mL pH 3.0的灭菌生理盐水，混匀，置80 ℃水浴20 min，再静止放置20 min，吸取上清200 μL涂于CMC-刚果红分离培养基，置37 ℃恒温培养24 h，观察结果。

1.2.2 产纤维素酶菌株的筛选与纯化 根据菌落周围酶解圈直径和菌落直径比值大小，由分离培养基上挑选产纤维素酶和酶活较高的菌株连续3次划线接种于种子培养基，37 ℃恒温培养48 h，置4 ℃冰箱放置24 h，采用革兰氏染色法筛选能够产生芽孢的杆菌。

1.2.3 复筛 取上述筛选的菌株的新鲜菌液2 μL滴种于CMC-刚果红培养基，于37 ℃恒温培养36 h，测量透明圈直径(H)和菌落直径(C)，选择二者比值(H/C)较大的菌株进一步进行酶活测定。

1.2.4 纤维素酶酶活测定 葡萄糖标准曲线绘制，方法参考国标法(GB/T 23881-2009)。取培养36 h的菌液，6000 r/min离心10 min，取上清1 mL，加入1 mL含1% CMC的pH 4.8醋酸-醋酸钠缓冲液，混匀，50 ℃恒温水浴30 min，加入2.5 mL DNS试剂，沸水浴5 min，冷却后定容到25 mL，在520 nm下比色，测出吸光度值，查阅标准曲线后，求出溶液中的葡萄糖含量。酶活力单位规定：在pH 5.0、50 ℃条件下，以1 mL纤维素酶液在1 min内水解羧甲基纤维素钠生成1 μmoL葡萄糖的酶量为1个单位(U)。

1.2.5 菌种的鉴定

1.2.5.1 形态学鉴定 将上述筛选的菌种在37 ℃下培养24 h，观察菌落形态，采用革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌体形态。

1.2.5.2 生理生化鉴定 菌株的生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[8]。

1.2.5.3 菌种16S rDNA分子鉴定 根据芽胞杆菌的16S rDNA序列模板设计一对引物，P1:5'-CTGCAGCTACCGGTCGCCACCATG-3'，P2:5'-GAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3'。按照基因组抽提试剂盒(北京方宝生物有限公司)抽提的芽孢杆菌基因组为模板，PCR反应体系如下：10×PCR buffer 5 μL，dNTP(10 mM) 1 μL，

MgCl22 μL，上下游引物(10 mM)各1 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 1 μL，模板DNA 1 μL，超纯水 36 μL。反应参数：94℃，3 min→(94 ℃，50 s→55 ℃，45 s→72 ℃，90 s，30 循环)→72 ℃，10 min→4 ℃，保存。将产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳，并送至上海生物工程技术服务有限公司测序。将测序结果提交到GenBank中进行BLAST比对，选取相似性较高的序列，利用DNAstar7.0软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株的初筛结果

将样品经酸和热处理后，在分离培养基上初步分离出具有纤维素酶酶活的菌株42株，将这些菌株纯化后分别滴种在CMC-刚果红培养基上，通过比较酶解圈直径H与菌落直径C的比值大小(见图1)，初步筛选出产纤维素酶较高的的菌株10株，结果见表1。由表1可知，所筛选出菌株的酶解圈与菌落直径比在1.33～3.71，其中B.LY02最大。

图1 部分菌株酶活平板筛选图Fig. 1 Strains producing cellulase by Congo red medium

2.2 菌株的复筛结果

由表2可见，B.LY02酶活最高，可达0.5351 U/mL。因此，筛选出该菌株进行鉴定和后期研究。

2.3 菌株的形态学鉴定

在普通肉汤平板上37 ℃培养24 h后发现菌落呈圆形，白色，表面湿润，有光泽，边缘整齐，单生或呈链状，两端钝圆，革兰氏染色阳性，有芽孢，且呈椭圆形，近中生(图2)。属于典型的芽孢杆菌的特征(图2C)。

表1 产纤维素酶菌株初筛结果Table 1 The screening results of cellulase-producing

注：H.酶解圈直径;C.为菌落直径。

Note: H.represents the diameter of hydrolysis circle;C.stands for the diameter of colonies.

表2 不同菌株纤维素酶的比活力测定结果Table 2 The results of cellulase specific activity of different strains U/mL

2.4 菌株的生理化性质鉴定

B.LY02生理生化结果见表3。由表3可见，接触酶阳性，可还原硫化氢、硝酸盐，可利用多种糖产酸，符合芽孢杆菌的典型特征。

图2 部分菌株显微形态图Fig. 2 Microscopic morphology diagram of some strains

表3 B.LY02生理生化试验结果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of Strain B.LY02

注：“-”代表阴性结果，“+”阳性结果。

Note:“-”represents negative result,“+”is for positive result.

2.5 菌株16S rDNA 分子鉴定结果

以菌株B.LY02基因组DNA为模板，经PCR扩增后在1%的琼脂糖凝胶上电泳，结果如图3所示，在约1 500 bp处有一明亮的条带，与预期大小一致。测序结果表明菌株B.LY02的16S rDNA序列长度为1 464 bp。

图3 16S rDNA片段PCR扩增结果1.阴性对照；2，3.PCR产物；4.MarkerFig. 3 PCR results of 16S rDNA fragment of strain B.LY021.Nagtive control; 2，3.PCR product;4.Marker

2.6 基于16S rDNA序列及系统进化树分析

将该序列提交到GenBank中进行BLAST比对，发现与地衣芽孢杆菌和球形芽孢杆菌两个种成员具有较高的相似性，利用DNAstar7.0软件包中Meglign中的Jotun Hein Method构建系统发育树，如图4所示，B.LY02与Bacillus licheniformis strain CICC10095(地衣芽孢杆菌)位于同一分支，同源性高达96.5%，亲缘关系最近，因此，初步鉴定该菌属于芽孢杆菌属地衣芽孢杆菌种。

3 讨 论

目前秸杆降解最有效的途径应该还是生物降解[5-7]，而细菌，尤其是芽孢杆菌，是动物饲料中应用最为广泛的一种益生菌，具有多种益生功能[9-10]。一般来说芽孢杆菌是细菌中产酶最多的菌种，而且酶活也较高[11-12]。本研究从自然界土壤中分离到了一株高产纤维素酶的芽孢杆菌，其新鲜培养液中酶的比活力最高可达0.5351 U/mL。严文岱等[1]分离的6株菌的纤维素酶比活力最高为0.2137 U/mL，郭成栓等[13]报道的短小芽孢杆菌的纤维素酶的比活力为1.96 U/mL。而段学辉等[15]从土壤中分离的绿色木霉CMC酶活力达146.68 U/mL，说明真菌分泌纤维素酶的能力强于细菌，所以可以根据实际需要，选择不同的菌株进行纤维素的降解。本研究将对该菌株进行诱变和产酶条件优化，进一步提高该菌株产纤维素酶的能力，我们将在以后的试验中验证其降解功效。

图4 菌株B.LY02基于16S rDNA序列系统进化树分析Fig. 4 The phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence of strain B.LY02

近年来关于产纤维素酶菌株分离的报道比较多[17-19]，但大多研究一般都是采用CMC作为底物，然后将样品稀释液涂布在分离培养基上，再采用刚果红染色挑出产酶菌，这种方法要先影印出分离培养基上的菌落，程序繁琐，工作量较大，且很难筛选到最优菌株[20-22]。而用刚果红染色的目的就是区分菌落周围是否含有纤维素，与刚果红和纤维素结合的时间没有关系，两者的结合是一种可逆反应。依据这个原理，本研究直接将过滤除菌的刚果红溶液在倒平板前加入到培养基中，使其终浓度为1.5%左右(浓度控制在1.5%～2.0%最佳)，当培养基中的CMC被细菌降解时，刚果红-纤维素复合物就会解离，从而在菌落周围显示出透明圈，可以更直观、快捷、准确地进行产纤维素酶菌株的筛选。从该试验的结果也可以看出，酶活测定的结果与透明圈和菌落直径的比值呈一定的相关性，所以采用这种方法有利于筛选到高纤维素酶活的菌株。另外，试验在对样品初处理时采用了80 ℃高温和pH 3.0处理，这对于有针对性地分离耐高温和耐酸菌株的分离是很有效的，尤其是芽孢杆菌的分离，因为绝大多数细菌很难在80 ℃和pH 3.0条件下存活20 min，试验结果也表明初分离的菌株绝大多数都是能够产芽孢的菌株，说明这是一种排除其它杂菌分离特定菌株的最有效的方法之一。

4 结 论

本研究从土壤中分离获得了一株高产纤维素酶的芽孢杆菌，经鉴定为地衣芽孢杆菌，而且该菌株具有耐热和耐酸的性能。建立了一个简便的产纤维素酶菌株的分离方法，为进一步从自然界中分离其它种类的产纤维素酶菌株提供了技术支持，为丰富益生菌菌种库奠定了基础。

参考文献:

[1] 严文岱，周东凯，杨翔华. 玉米秸杆纤维素分解菌的选育研究[J].生物学杂志，2005，22(6):29-31.

[2] 史 央，戴传超，吴耀春，等. 植物内生真菌强化还田秸杆降解的研究[J].环境科学学报， 2004，24(1)：144-149.

[3] 祖彩霞，李志敏，叶 勤. 里氏木霉Trichoderma reesei产纤维素酶的发酵培养基碳氮源优化[J].生物加工过程，2011，9(4)：6-10.

[4] Li W,Huan X J,Zhou Y, et al. Simultaneous cloning and expression of two cellulase genes from Bacillus subtilis newly isolated from Golden Takin (Budorcas taxicolor Bedfordi)[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2009, 383(4): 397-400.

[5] 屈二军，谢 展，马孟星，等.高产纤维素酶的绿色木霉菌种的诱变和筛选[J]. 农业与生物技术学报，2011，12(10)：1 411-1 412.

[6] 杜万清，马富英，翁昌龙，等.白腐菌胞外提取液与纤维素酶对玉米秸秆的协同酶解研究[J]. 工业微生物，2011，41(1)：41-45.

[7] 马 光，郭继平.米曲霉发酵玉米秸秆产纤维素酶饲料条件的优化[J].生物技术，2010，20(6)：15-19.

[8] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[9] Saeed Z N, Mehran H R, Ghobad A T, et al. The effect of Bacillus spp. bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity, survival and growth in the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus[J]. Aquaculture, 2006, 252(2-4): 516-524.

[10] Simon M C. Bacillus probiotics [J]. Food Microbiology, 2011, 28(2): 214-220.

[11] Thuy T T, Suhaila O H, Yasser G, et al. Thermostable alkaline phytase from Bacillus sp. MD2: Effect of divalent metals on activity and stability[J]. Journal of Inorganic Biochemistry, 2011, 105(7):1 000-1 007.

[12] Yan M, Ying Z, Rui-Rui C, et al. Combined effects of three crystalline toxins from Bacillus thuringiensis with seven proteinase inhibitors on beet armyworm, Spodoptera exigua Hübner (Lepidoptera: Noctuidae) [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology,2013,105:169-126.

[13] 郭成栓，欧阳蒲月，崔堂兵，等. 一株碱性纤维素酶产生菌的分离、鉴定及酶谱分析[J].生物技术，2011，21(1):57-59.

[14] Crispen M, Rajni H K,Remigio Z, et al. Purification and characterization of cellulase produced by two Bacillus strains[J]. Journal of Biotechnology, 2000, 83(3): 177-187.

[15] 段学辉，颜淑芳，高 鹤. 几株纤维素酶产生菌的分离鉴定及其产酶能力[J].南昌大学学报：工科版，2010，32(2)：134-139.

[16] Nitin T, Vishal G, Manoj K, et al. An alkali-halotolerant cellulase from Bacillus flexus isolated from green seaweed Ulva lactuca[J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 83( 2):891-897.

[17] Sushil N, Anuradha M, Davender K, et al. Production of alkali tolerant cellulase free xylanase in high levels by Bacillus pumilus SV-205 [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2012,50(2): 414-420.

[18] Gurdeep R, Aditya B, Akash A, et al. Characterization of thermostable cellulases produced by Bacillus and Geobacillus strains [J]. Bioresource Technology, 2010, 101(22): 8 798-8 806.

[19] Zeliha N S，Burhan A. A cellulase-free, thermostable, alkaline-stable, inhibitor resistant and halotolerant xylanase produced by an alkaliphilic Bacillus sp. X6 and its applications in various industries[J]. New Biotechnology, 2012,29(23-26): 98-99.

[20] Aboozar K, Narges N, Abdollah G, et al. An optimized medium for cellulase production by Bacillus sp. BCCS A3[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2010, 22(1): 68.

[21] 王希国，杨 谦，燕 红.高效降解纤维素菌株的筛选与鉴定[J].饲料与添加剂，2007(8)：70-71.