普洱毛脚乌鸡与南涧绿耳乌鸡线粒体DNA母系遗传分析

苗永旺，孙利民，童晶晶，李大林，袁跃云，杨满灿，郝伟峰，霍金龙，杨 润，余仕亮，杨光强，王 群

(1. 云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201；2. 云南省家畜改良工作站，云南 昆明 650225；3. 云南省普洱市畜牧工作站, 云南 普洱思茅区665000；4. 云南省景东县畜牧工作站，云南 景东676200)

云南境内的无量山、哀牢山两山脉之间大多地区海拔高差大，地形地貌复杂气候明显。在该地区独特的自然生态环境条件下，经过当地居民长期的选育形成了独特的地方鸡种资源。2009年9月经国家畜禽遗传资源委员会现场鉴定，把分布于无量山、哀牢山地区的乌骨鸡资源统称为无量山乌骨鸡[1]。2011年将之收录到《中国畜禽遗传资源志·家禽志》中[2]。据统计，2006年该鸡存栏84万只。近年存栏逐年增加，群体数量呈上升趋势。无量山乌骨鸡为常羽乌骨鸡，毛色有麻花、黄、白等色。该鸡体大结实，适应性强，乌皮、乌骨、乌肉，肉质极佳。中心产区为云南普洱市景东县、镇沅县和大理州南涧县。在普洱市的墨江、景谷、宁洱等县，大理州的漾濞、永平、巍山和云龙等县也有分布。由于无量山乌骨鸡分布的地理区域广，在其大群体内形成了具有一定遗传和生产性能差异的地方鸡群体。差异比较明显的是以分布在普洱景东县及邻近地区的普洱毛脚乌鸡群体和以分布在大理南涧县的绿耳乌鸡群体为代表。在外观上，普洱毛脚乌鸡体型高大，屠宰率高，通常脚有胫羽、趾羽，故称“毛脚鸡”。毛脚性状在鸡群中较普遍存在，但绿耳性状只是零星存在。而南涧绿耳乌鸡体型中等，绿耳性状在群体中普遍存在，但毛脚性状特征在群体中不显著。过去，人们对该地区家鸡研究较少，对其群体遗传背景和种质遗传特性知之甚少。采用现代遗传学手段对分布于无量山、哀牢山地区不同类型的乌骨鸡群体进行遗传背景分析，找出它们间的遗传差异，对开发利用该地区优良地方鸡种资源具有重要意义。

高等生物的线粒体DNA(mtDNA)进化速率比核基因高数倍，其控制区(D-loop region)突变速度又较其它区域高。因此，mtDNA D-loop积累突变较多，作为遗传标记用于种下遗传多样性和群体遗传组成分析，效果好、灵敏度高[3-4]。目前，世界家鸡的mtDNA世系组成及其分布已基本清楚[5-6]，这为我国地方鸡种的遗传分析奠定了基础。本研究以mtDNA D-loop第I高变区长520 bp的序列为遗传标记，对普洱毛脚乌鸡和南涧绿耳乌鸡两个地方鸡群体进行了变异检测和系统发育、群体遗传组成分析，以期为云南哀牢山、无量山地区乌骨鸡种质资源的类群划分、保护和选育利用提供遗传背景资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究共采集家鸡样品96份，其中包括普洱毛脚乌鸡样品48份(♀：25, ♂：23)、南涧绿耳乌鸡样品48份(♀：24, ♂：24)。样品分别采自云南省普洱市景东县和大理州南涧县，在核心产区随机取样，样本个体间不存在直接血缘关系。翅下静脉采血，每只鸡2 mL，与DNA保存液混合后，低温带回实验室，用于基因组DNA提取。

1.2 基因组DNA提取

参照苗永旺等[7]的方法提取基因组DNA，经检测其纯度和浓度，稀释成100 ng/μL，用于后续群体变异检测分析。

1.3 PCR扩增及序列测定

采用Liu等[5]的引物进行目的片段扩增和测序：正向引物：5'-AGGACTACGGCTTGAAAAGC-3'；反向引物：5'-ATGTGCCTGACCGAGGAACCAG-3'。

PCR反应体系总体积为25 μL，含模板DNA(50～100 ng)1 μL，ddH2O 19.375 μL，10×Buffer 2.5 μL(Mg2+浓度15 mM)，dNTP(各2.5 mM)1 μL，正、反向引物(20 μM)各0.5 μL，Taq酶(TaKaRa)0.125 μL。

PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；然后94 ℃ 1 min，63 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，运行35个循环；再72 ℃延伸5 min，最后4 ℃终止反应。

PCR产物经琼脂糖凝胶(1.5%)电泳检测后，采用试剂盒(Promage产品)进行回收纯化，送百泰克生物技术有限公司进行正、反链双向测序。

1.4 数据分析

采用DNAstar软件包(DNAstar Inc.)对所得序列进行核对，然后使用ClustalX软件进行序列比对，再用DnaSP 5.0软件[8]对群体的多态位点数、单倍型数、单倍型多样度和核苷酸多样度及核苷酸差异数等参数进行分析。序列碱基组成分析、突变位点输出、遗传距离计算和无根系统树的构建，采用MEGA 4.0软件[9]完成。本文序列单倍型的定义以NCBI数据库中一条红原鸡序列NC_007235为参考序列。

2 结果和分析

2.1 序列变异分析

本研究96个家鸡样品mtDNA D-loop序列长度均为520 bp，共检测到31个多态位点，其中单一变异位点2个，简约信息位点29个。根据突变位点定义19种单倍型。单倍型多样度为0.884±0.019，核苷酸多样度为0.01586±0.00035；序列核苷酸差异平均数为8.250。序列碱基组成A、G、T和C的平均含量分别为27.4%、12.6%、30.2%和29.8%。

在普洱毛脚乌鸡中，共检测到24个核苷酸多态位点，序列变异率为4.81%，其中单一变异位点2个，简约信息位点22个；序列中T、C、A和G的平均含量分别为30.2%，29.8%，27.4%和12.7%；共定义12种单倍型，独有单倍型为6个，占该群体单倍型总数的50%(6/12)。该群体单倍型多样度为0.829±0.039，核苷酸多样度为0.01559±0.00068；群体内序列间核苷酸差异的平均数是8.106，群体内遗传距离为0.016±0.003。在南涧绿耳乌鸡中共检测到28个核苷酸多态位点，序列变异率为5.58%，其中单一变异位点0个，简约信息位点28个，共定义了13种单倍型，独有单倍型为7个，占该群体单倍型总数的53.85%(7/13)。序列碱基A、G、T和C的平均含量分别为27.4%、12.6%、30.3%和29.7%，单倍型多样度为0.907±0.018，核苷酸多样度为0.01590±0.00056，序列间平均核苷酸差异数是8.270，群体内遗传距离也为0.016±0.003。两群体间遗传距离为0.019±0.004。在两群体中检测到的变异位点及其单倍型世系分布信息见表1。

2.2 群体遗传分化和系统发育分析

采用邻接法(Neighbor-jointing, NJ)构建的无根系统树见图1和图2。在系统发育树上，普洱毛脚乌鸡序列聚为5大支，而南涧绿耳乌鸡聚为6大支。按照Miao等[6]的家鸡mtDNA世系划分及各世系突变模式，可将本研究所有个体划分到已命名的家鸡A、B、C、E、F和G等世系中。普洱毛脚乌鸡与南涧绿耳乌鸡的世系划分与各自系统树上的支系相一致。普洱毛脚乌鸡包含A，B，E，F和G五个世系，其中A世系占45.83%，B世系占2.08%，E世系占8.33%，F世系占16.67%，G世系占27.09%。A世系在该鸡群体中占优势，其次是G世系。南涧绿耳乌鸡包含A，B，C，E，F和G六个母系世系，其中A世系占22.92%，B世系占14.58%，C世系占4.17%，E世系占10.42%，F世系占16.67%，G世系占31.25%。G世系在该鸡群体中占优势，其次是A世系。

表1 多态位点信息及所定义的单倍型Table 1 The information of the polymorphic sites, lineage and defined haplotypes

注：ST:为序列NC_007235；图中点(o)代表与参考序列核苷酸相同；Maojiao代表普洱毛脚乌鸡; Lver代表南涧绿耳乌鸡。

Note：ST:the sequence NC_007235; Dots (o) are identified with the reference sequence；Miaojiao：Puer maojiao black-bone chicken；Lver: Nanjian Lver black-bone chicken.

图1 基于普洱毛脚乌鸡所有样品mtDNA D-loop序列构建的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on mtDNA D-loop sequences of Puer Maojiao black-bone chicken

图2 基于南涧绿耳乌鸡所有样品mtDNA D-loop序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on mtDNA D-loop sequences of Nanjian Lver black-bone chicken

3 讨 论

相对于单倍型多样度而言，核苷酸多样度不受样本大小和序列长度的影响，是衡量群体遗传多样性的可靠指标。本研究在48只普洱毛脚乌鸡中发现24个核苷酸多态位点，序列变异率为4.81%，核苷酸多样度为0.01559±0.00068。而在南涧绿耳乌鸡中共发现28个核苷酸多态位点，序列变异率为5.58%，核苷酸多样度为0.01590±0.00056。这表明南涧绿耳乌鸡的遗传多样性水平高于普洱毛脚乌鸡。近年，已有人采用相同的序列区段为遗传标记，分析了我国一些地方鸡种的遗传多样性。已报道，云南华坪乌骨鸡群体的核苷酸多样度为0.01547±0. 00085[10]，与本研究的两个云南地方鸡群体相近。对仙居鸡、灵昆鸡、来航鸡、白银耳鸡、萧山鸡、白羽乌骨鸡的检测显示，这些鸡种的核苷酸多样度从0.00111～0.1239不等，平均值为0.01183[11-13]。包文斌等[13]对中国14个地方鸡种的遗传分析显示，各群体核苷酸多样度从0.000～0.01963不等，其中有10个群体核苷酸多样度均在0.01510以下。这表明，普洱毛脚乌鸡和南涧绿耳乌鸡遗传多样性在我国地方鸡种中处于较高的水平，揭示其群体遗传多样性丰富。这与它们饲养管理粗放，选育程度低的实际情况相符。

Liu等[5]采用相同的遗传标记对家鸡和红原鸡的mtDNA世系及遗传分化的研究表明，世界家鸡和红原鸡共包含9个世系，这些世系存在一定的系统地理分布。最近，Miao等[6]基于家鸡线粒体全基因组序列构建了mtDNA系统发育树并对单倍型类群进行了详细界定，基于该系统发育树，对世界各地大样本mtDNA控制区序列进行了重新分析，确定世界家鸡及其近缘种红原鸡可分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、W和X等世系，从而揭示出分别发生在南亚和中国西南及其邻近东南亚地区的局部驯化事件。本研究普洱毛脚乌鸡样品具有A、B、E、F和G等5世系；而南涧绿耳乌鸡拥有A、B、C、E、F和G等6世系。这表明普洱毛脚乌鸡在群体遗传组成上具有5个母系血统来源，而南涧绿耳乌鸡具有6个母系血统来源，支持家鸡多个母系起源的观点[5-6]。但两个家鸡群体的遗传组成存在明显差异：普洱毛脚乌鸡中未发现有C世系，A世系占的比例最多，其次为G世系，第三大世系为F世系，B世系占的比例最少；A、G和F世系三者的比例为89.59%。而在南涧绿耳乌鸡中，G世系占的比例最多，其次为A世系，F世系为第三大世系，A、G和F世系三者的比例为72.42%；该鸡中B世系的比例明显高于普洱毛脚乌鸡，但F世系的比例与普洱毛脚乌鸡相当。从单倍型来看，普洱毛脚乌鸡中独有单倍型占50%，而南涧绿耳乌鸡中独有单倍型占53.85%，这表明两者群体具有较大遗传差异。同时，两群体间遗传距离为0.019±0.004，大于各自群体内遗传距离，揭示两群体存在一定遗传分化。普洱毛脚乌鸡主要分布于哀牢山地区，而南涧绿耳乌鸡主要分布于无量山地区，两者的遗传差异可能与两地家鸡群体的长时间隔离、遗传漂变及两地居民的养殖习惯和选育差异有关。

根据现有世界家鸡的mtDNA世系地理分布[5-6]，A和B世系为东亚和东南亚地区普遍存在的世系，C世系为东亚特有世系，E为南亚和欧美商品鸡中普遍存在的世系，F和G为云南及相邻地区特有世系。本研究普洱毛脚乌鸡群体中云南特有世系占43.76%，东亚和东南亚地区(含云南)血统占91.67%；南涧绿耳乌鸡中云南特有世系占47.92%，东亚和东南亚地区(含云南)血统占89.58%。这揭示这两个地方鸡群体在母系血统上主要为东亚和云南及云南周边地区地方鸡血统。但在它们群体中还有少量的属于南亚和西方商品鸡中普遍存在的血统(E世系)，提示它们可能存在一定比例的欧美商品鸡血液渗入。

4 结 论

本研究从母系遗传角度揭示了云南境内哀牢山地区普洱毛脚乌鸡和无量山地区南涧绿耳乌鸡的遗传多样性和遗传差异。两者群体遗传多样性较高，南涧绿耳乌鸡的遗传多样性相对高于普洱毛脚乌鸡。两个地方鸡群体存在一定遗传分化，它们的群体遗传组成明显不同，揭示两群体遗传差异较大。在血统来源上，两者主要为地方土鸡血统，但可能有少量商品鸡血液渗入。有关它们的遗传差异还有必要采用核基因标记进行深入研究。本研究可为哀牢山-无量山地区乌骨鸡种质资源的类群划分和保护提供依据。

参考文献：

[1] 刘和良，李秀珠，左继旺，等.南涧县无量山乌骨鸡遗传资源保护利用现状调研报告[J].新农村(黑龙江),2012(1):121-122.

[2] 国家畜禽遗传资源委员会组编[M].中国畜禽遗传资源志(家禽志)，北京：中国农业出版社出版,2011:318-321.

[3] Bruford M W, Bradley D G, Luikart G. DNA markers reveal the complexity of livestock domestication [J]. Nat Rev Genet, 2003, 4: 900-910.

[4] 陈善元，张亚平. 家养动物起源研究的遗传学方法及其应用[J]. 科学通报，2006，51(21)：2 469-2 475.

[5] Liu Y P, Wu G S, Yao Y G, et al. Multiple maternal origins of chickens: out of the Asian jungles[J]. Mol Phylogenet Evol,2006,38(1): 12-19.

[6] Miao Y W, Peng M S, Wu G S, et al. Chicken domestication: an updated perspective based on mitochondrial genomes[J]. Heredity (Edinb). 2012 Dec 5. doi: 10.1038/hdy.2012.83.

[7] 苗永旺，霍金龙，李莲军，等. 从鸡血中快速提取高质量基因组DNA方法的研究[J]. 黑龙江畜牧兽医，2005，(12)：10-12.

[8] Rozas J, Sanchez-Delbarrio J C, Messeguer X, et al. DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods [J]. Bioinformatics. 2003, 19(18): 2 496-2 497.

[9] Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 [J]. Mol Biol Evol. 2007, 24(8): 1 596-1 599.

[10] 刘丽仙，苗永旺，孙利民，等.华坪乌骨鸡mtDNA D-loop遗传多样性分析[J].畜牧与兽医，2012, 44 (10): 30-32.

[11] 傅 衍，牛 冬，阮晖，等. 浙江省地方鸡的遗传多样性的研究[J].遗传学报，2001，28 (7)：606-613.

[12] 傅 衍，牛 冬，阮 晖，等. 丝羽乌骨鸡与其它鸡种遗传关系的研究[J].中国畜牧杂志， 2002，38 (1)：5-7.

[13] 包文斌，束婧婷，王存波，等. 中国家鸡和红色原鸡mtDNA控制区遗传多态性及系统进化分析[J].畜牧兽医学报，2008，39(11)：1 449-1 459.