大蒜素对脂多糖诱导的大鼠肺组织水通道蛋白-1表达的影响*

陈华文 冯 俊△ 易旻晓 祝 伟 李树生

（1.华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉 430030；2.华中科技大学同济医学院第二临床学院，湖北 武汉 430030）

急性肺损伤（ALI）是以通透性肺水肿为特征的一种临床综合征，目前其发病机制尚未完全阐明。研究表明水通道蛋白-1（AQP-1）与肺水肿有关，AQP-1对于维持血管与间质之间水运动的平衡有重大意义［1］。大蒜素为植物大蒜中的重要活性成分，其对多种微生物具有强大的抑制和杀灭作用，实验研究发现大蒜素对脂多糖（LPS）致脓毒症急性肺损伤具有保护作用［2］。本研究主要观察脂多糖致大鼠ALI时AQP-1表达的变化情况，并给予大蒜素干预，探讨大蒜素对脂多糖诱导的急性肺损伤的具体机制，以期为治疗脓毒症提供更充分的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂 内毒素（EscHErichiacoh055：B5，L2880美国 Sigma公司），抗 AQP-1 抗体（chemicon 公司）；SP试剂盒和DA B显色试剂盒、大蒜素（武汉博士德生物技术有限公司）；Trizol提取液（15596-026美国Gibco-BRL公司），RT-PCR试剂盒 （大连宝生物公司），PCR引物（上海生物工程有限公司合成）。

1.2 动物与分组 成年SPF级雄性SD大鼠30只，体质量220～250 g，8～10周龄，由同济医学院动物中心提供。按随机数字表随机分为LPS组、大蒜素组和对照组，每组10只。

1.3 造模及给药 通过鼠尾静脉注射LPS复制内毒素大鼠模型。LPS组和大蒜素组给予LPS 5 mg/kg，用生理盐水稀释至2 mL静脉注射，对照组给予生理盐水2 mL静脉注射。造模成功后，大蒜素组立即给予大蒜素20 mg/kg，用生理盐水稀释至2 mL静脉注射，LPS组和对照组给予生理盐水2 mL静脉注射。

1.4 标本采集与检测 分别在用药后6 h时间点随机快速处死大鼠，取右肺叶作病理切片备用；另取右中肺组织放入装有RNA保护液的冻存管内迅速置于-80℃冰箱保存备用。（1）病理学检测：取大鼠肺组织，10%中性甲醛固定，脱水后常规石蜡包埋，切片厚度4 μm，苏木精-伊红染色，普通光学显微镜400倍下观察肺组织病理学变化。（2）免疫组化法检测肺组织AQP蛋白分布：采用SP法，切片经常规脱蜡、水化后，用3% 过氧化氢去除内源性氧化酶，微波抗原修复，余步骤按试剂盒说明书进行。用已知阳性片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。AQP-1抗体稀释浓度为1∶400。细胞胞质呈棕黄色着染者为阳性表达细胞。（3）实时定量PCR检测肺组织AQPsmRNA表达：取右肺中叶组织，采用TRIzol试剂参照说明书提取总RNA，取2 μg RNA逆转录合成cDNA，其中2 μL cDNA为模板扩增，肌动蛋白β-actin为内参照，并设阴性对照。反应条件相同。AQP-1 引物序列：Forward primer（5′-3′）5′-CTGGCCTTTGGTTTGAGCAT-3′；Reverse primer（5′-3′）5′-CCACACACTGGGCGATGAT′；β-actin 引物序列：Forward primer （5′-3′）5′-ACGGCCAGGTCATCACTATTG-3′；Reverse primer （5′-3′）5′-TGGATGCCACAGGATTCCAT-3′。

1.5 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（）表示，多个样本均数比较采用方差分析及q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺组织病理学结果 镜下所示对照组肺组织结构正常。LPS组可见肺组织弥漫性中性粒细胞浸润，肺泡腔变窄，肺泡壁增厚，肺间质充血水肿明显，部分肺泡融合。大蒜素组中性粒细胞浸润有所减轻，肺间质水肿减轻。

2.2 各组大鼠肺组织AQP-1蛋白表达 对照组正常肺组织表达高水平AQP-1蛋白，染色呈棕黄色颗粒，可见在气道周围毛细血管和肺泡毛细血管内皮细胞上呈明显棕黄色分布。LPS组肺组织AQP-1蛋白表达显著下降，大蒜素组肺组织AQP-1蛋白表达较LPS组升高，但仍低于正常水平。见表1。

表1 各组肺组织AQP-1免疫组化染色结果比较（）

表1 各组肺组织AQP-1免疫组化染色结果比较（）

与对照组比较，*P＜0.05；与LPS组比较，△P＜0.05。下同。

2.3 各组大鼠肺组织AQP-1 mRNA的表达 见表2。与对照组比较，LPS组肺组织AQP-1mRNA表达明显降低（P<0.05），大蒜素干预后，肺组织AQP-1蛋白表达较LPS组升高，但仍低于正常水平（P<0.05）。

表2 各组肺组织中AQP-1 mRNA表达比较（）

表2 各组肺组织中AQP-1 mRNA表达比较（）

3 讨 论

ALI发病机制十分复杂，肺泡内液体清除障碍是重要发生机制之一。在肺组织肺泡内水的转运主要有两条途径，一是伴钠的主动转运，二是经肺泡上皮的水通道蛋白（AQPs）。研究表明，AQPs与肺水肿有关，是一组与水通透性有关的细胞膜转运蛋白，它的发现在分子水平揭示了水跨膜转运调节的基本机制，分布于肺组织中的AQPs有6种，AQPs组织分布的显著特点为同一细胞定位上没有两种以上AQPs重叠分布［2］。AQP-1主要在气道周围毛细血管、淋巴管及肺泡毛细血管内皮细胞和脏层胸膜间皮细胞上表达，主要负责清除支气管和脉管周围组织的内水分［3］，各种肺损伤常伴有肺水肿的发生，而肺水肿以肺泡和间质内液体积聚为特点，发生时必然伴有水转运紊乱及AQPs质或量的改变。研究发现AQP-1表达下降会导致跨细胞水转运的速率降低，从而影响水肿液吸收，加重肺泡和间质水肿，从而加重其肺组织的病理性改变［4-5］。已有研究证实，在静脉注射LPS致ALI模型中，以LPS 4 mg/kg剂量可以达到理想效果，并且4～12 h出现明显肺水肿，检测肺泡毛细血管内皮AQP-1蛋白表达数量明显减少［6］，本实验观察到观察到注射LPS后可迅速下调肺组织AQP1基因的表达，与雷贤英等［7］实验结果一致。

大蒜素化学名称为二烯丙基三硫，有较强的抗炎、抗氧化及清除氧自由基的作用［8-9］，对LPS导致的小鼠ALI具有防治作用，其机理与其能降低炎症因子水平有关。本研究发现，应用大蒜素的治疗组较LPS组肺组织AQP-1的蛋白和mRNA的表达均明显升高，同时HE染色病理学检查表明肺组织损伤明显减轻，表明大蒜素对内毒素血症时肺尤其是内毒素血症早期具有保护效应，且其机制可能与调节肺组织AQP-1的表达有关，AQP-1在调节肺内液体平衡中起到明显作用，可能参与了ALI肺水肿的发病机制，大蒜素可能通过干预AQP-1的表达改善脓毒症肺损伤的病理变化。

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