百事乐胶囊对慢性应激抑郁大鼠海马BDNF和TrkB表达的影响*

郭 纯 王宇红， 蔡光先，△ 李东雅 蔺晓源 易 健

（1.湖南中医药大学第一附属医院 省部共建中医内科学教育部重点实验室，湖南 长沙 410007；2.湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410208）

抑郁症是一种常见的情感性精神障碍性疾病，具有高患病率、高复发率、高致残率和高致死率等特点。脑源性神经因子（BDNF）属于神经营养素家族，对发育过程中神经元的存活、分化以及成年神经元的存活和功能起重要作用。研究表明，BDNF及其受体酪氨酸激酶B（TrkB）在抗抑郁治疗中发挥重要作用［1］。本研究采用慢性不可预见性应激复制抑郁模型大鼠，观察海马BDNF和TrkB的表达及中药复方百事乐胶囊的干预作用。

1 材料与方法

1.1 动物 SD大鼠32只，雌雄各半，体质量160～180 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2009-0004。

1.2 试药与仪器 百事乐胶囊，由湖南省中医药研究院制备，规格0.38 g/粒，成人日用量9粒，相当于生药15 g/d，批号20110322。盐酸氟西汀，礼来苏州制药有限公司生产，规格20 mg/粒，成人用量为20 mg/d，批号J20080016。BDNF、TrkB多克隆抗体，购自北京博奥森生物技术有限公司；PV9000试剂盒、DAB显色剂，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。YLS-9A生理药理电刺激仪 （山东省医学科学院设备站）；Finesse 325型石蜡切片机 （英国Shando公司）；Bx51光学显微镜及IPP6.0图像分析系统（日本Olympus公司）。

1.3 模型制备 32只SD大鼠区分雌雄适应性饲养3 d后，按雌雄各半随机选取8只作为正常组，正常饮水摄食，不给予任何刺激。其他大鼠单笼孤养，并接受各种应激刺激，刺激方法参照Kart法改进，包括：12 h禁食，12h禁水，光照过夜，6℃冷水游泳5 min，45℃热水游泳5 min，夹尾 5 min，潮湿饲养，超声刺激 1 h（50 kHz），电击足底（电压50 V，每隔1 min刺激1次，每次持续30 s，共5次）。每日随机给予1种刺激，使大鼠不能预料刺激的发生，以避免产生适应，持续21 d。

1.4 分组与给药 大鼠给予21 d刺激后，根据同阶层行为学指标按随机数字表法将实验动物分为模型组、氟西汀组、百事乐组，每组雌雄各半。每日灌胃给药1 h后，再随机给予1种刺激，持续21d。模型组大鼠灌胃蒸馏水，氟西汀组大鼠灌胃盐酸氟西汀药液1.8mg/（kg·d），百事乐组灌胃百事乐胶囊药液，根据体表面积将成人日用量换算成大鼠日用量，按生药量为1.33 g/（kg·d），灌胃量为1 mL/100 g体质量。

1.5 行为学测定 于造模前1 d，造模第21日，给药第21日在安静房间内采用Open-field法进行行为学测定。实验用黑色敞箱为方形（80 cm×80 cm×40 cm），底面用白线划分为面积相等的25个格子。实验时将动物放在正中，以动物三爪以上跨入邻格计为水平活动1分，两前肢离地或攀附墙壁1 cm以上计为垂直活动1分。每只大鼠适应1 min后，记录3 min内的水平和垂直得分。

1.6 免疫组织化学检测与分析 于给药第22日用10%水合氯醛（3.0 mL/kg）腹腔注射麻醉动物，断头取脑，于4%多聚甲醛中固定24 h。将脑组织酒精梯度脱水，二甲苯透明，然后石蜡浸透、包埋。包埋材料修块后行冠状切片，片厚5 μm。切片放入3%过氧化氢孵育10 min，灭活内源性过氧化物酶，0.01 mol/L PBS洗3 min，3次；转移至装满PBS的微波修复缸中，加热至沸腾30 s，进行抗原修复，0.01 mol/L PBS洗 3 min，3次；各组动物脑组织切片分别滴加入稀释的兔抗大鼠BDNF多克隆抗体（1∶100）和兔抗大鼠TrkB多克隆抗体 （1∶100）50 μL， 阴性对照用 0.01 mol/L PBS 替代一抗，37℃冰箱孵育 2 h，0.01 mol/L PBS洗 3 min，3次；滴加PV-9000试剂盒的生物素标记的山羊抗兔二抗，37℃孵育 30 min，0.01 mol/L PBS洗 3 min，3次； 滴加PV-9000试剂盒辣根过氧化物酶标记链酶卵白素，37℃孵育20 min，0.01 mol/L PBS洗3 min，3次； 滴加DAB显色剂室温显色10 min，蒸馏水洗终止反应；将切片放入苏木素染液中染色10 min，流水冲洗5 min，0.5%盐酸酒精分化液中分色10 s，流水冲洗2 min，镜检着色较好后，蒸馏水清洗切片；梯度酒精和二甲苯脱水透明切片，中性树脂封片。对于BDNF每一指标每个脑组织取3张切片，每张切片于400倍物镜下随机选取海马区域5个视野，用Image Pro Plus 6.0图像处理系统进行阳性表达面积计算。

1.7 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件。计量资料以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 百事乐胶囊对慢性应激抑郁大鼠行为学的影响见表1。旷场实验测定各组大鼠的水平和垂直活动次数，与正常组相比，造模后各组动物的水平和垂直活动次数均下降（P<0.05或0.01）。给药后，百事乐组动物活动水平显著增加，水平活动次数和垂直活动次数与模型组相比差异均有统计学意义（P<0.05或0.01）。

表1 大鼠旷场试验水平和垂直运动次数（）

表1 大鼠旷场试验水平和垂直运动次数（）

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

2.2 百事乐胶囊对慢性应激抑郁大鼠海马BDNF和TrkB表达的影响 应用免疫组化方法检测BDNF和TrkB在大鼠海马中的表达，以胞浆或突起染成棕黄色为阳性表达。由图1、图2和表2可知，大鼠海马中BDNF的阳性表达高于TrkB的阳性表达；与正常组相比，模型组大鼠海马BDNF和TrkB阳性表达面积明显减少 （P<0.01）；与模型组相比，百事乐组大鼠海马BDNF和TrkB的阳性表达面积明显增多（P<0.01），其数值与正常组和氟西汀组接近。

3 讨 论

图1 免疫组化显示海马BDNF的表达（400倍）

图2 免疫组化显示海马TrkB的表达（400倍）

表2 大鼠海马BDNF和TrkB阳性表达面积（）

表2 大鼠海马BDNF和TrkB阳性表达面积（）

抑郁症属中医“郁证”范畴，病始在肝，及于心神。中药复方以多成分、多环节、多层次、多靶点的药理学作用见长，擅长身心整体调理，在抑郁症的治疗中具有一定优势，因此，探索抗抑郁中药的作用机制备受关注。百事乐胶囊由姜黄、人参和贯叶连翘组成，具有疏肝解郁、宁心安神的功效，其临床疗效确切，是治疗抑郁症的有效专药［2］。前期对其抗抑郁作用机制进行了一些有益的探索，研究表明百事乐胶囊能显著改善慢性应激抑郁小鼠的行为学变化，下调慢性应激所致小鼠血清白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α水平［3］，上调慢性应激抑郁小鼠脑内BDNF、NGF的表达［4］。

BDNF是神经因子家族的重要成员，其作用比较广泛。BDNF在胚胎发育期对神经系统的发育、分化、成熟以及突触的形成不可缺少，在成年期对神经功能的调节和神经系统的可塑性具有重要作用［5-6］。临床和基础研究的结果表明，抑郁症会降低BDNF的表达和神经发生。而抗抑郁治疗可逆转这一效应，并形成了抑郁症的神经营养因子假说［1］。BDNF在抑郁症的治疗中可能主要通过3方面发挥作用［7］：第一，增加突触可塑性，进而影响长时程增强（LTP），而LTP是学习和记忆形成的基础；其次，促进神经发生，尤其是海马的神经发生，提高海马神经元的存活；第三，促进细胞生存，对各种神经元的发育分化与生长再生具有维持和促进作用。

BDNF是基因与环境、突触可塑性和细胞凋亡相互关联不可缺少的信息传递环节，在精神异常疾病中发挥重要作用［8］。BDNF通过与特异性受体TrkB结合，使TrkB自身磷酸化，进而激活钙调蛋白激酶、丝裂原活化蛋白激酶途径、磷酸肌醇3-激酶途径等信号通路，最后激活cAMP反应元件结合蛋白，引起BDNF和抗调亡蛋白Bcl-2等表达增加，以增加突触可塑性、促进细胞生存和神经发生。TrkB信号通路与脑的营养效应相关联，而很多精神治疗药物也普遍性地以提高BDNF 的表达水平为目标［9］。

本研究结果显示，相比于正常组，模型组大鼠行为学活动水平明显降低，海马BDNF和TrkB的表达显著下降；百事乐胶囊能改善慢性应激抑郁大鼠的行为学活动水平，提高大鼠海马BDNF和的表达，与正常组和氟西汀组接近。因此，提高海马BDNF及其受体TrkB的表达，是百事乐胶囊促进海马神经功能恢复的作用机制之一，但其深入的机制还有待进一步研究。

［1］Megan E，Kozisek，David M，et al.Brain-derived neurotrophic factor and its receptor tropomyosin-related kinase B in the mechanism of action of antidepressant therapies［J］.Pharmacology&Therapeutics，2008，117（1）：30-51.

［2］李东雅.百事乐胶囊治疗肝气郁结型抑郁症的临床研究［D］.长沙：湖南中医药大学，2011.

［3］郭纯，蔡光先，刘柏炎，等.百事乐胶囊对慢性应激抑郁小鼠血清IL-1β和TNF-α的影响［J］.湖南中医药大学学报，2012，32（11）：24-26.

［4］郭纯，蔺晓源，杜可，等.百事乐胶囊对慢性应激抑郁小鼠神经因子表达的影响［J］.湖南中医杂志，2013，29（1）：121-123.

［5］Kata LC，Lo DC.Neurotrophins and synaptic plasticity ［J］.Annu Rev Neurosci，1999，22（2）：295-318.

［6］Alejandro FS，Mu-ming P.The neurotrophin hypothesis for synaptic plasticity［J］.TrendsinNeurosciences，2000，23（12）：639-645.

［7］周小江，胡园，刘屏.脑源性神经营养因子与抑郁症的研究进展［J］.生物化学与生物物理进展，2011，38（12）：1085-1090.

［8］Sivasankaran B，Aleksandar J.Brain derived neurotrophic factor：a novel neurotrophin involved in psychiatric and neurological disorders［J］.Pharmacology&Therapeutics，2012，134（1）：116-124.

［9］Fabien B，Gunter K，Maxime C，et al.TrkB inhibition as a therapeutic target for CNS-related disorders ［J］.Progress in Neurobiology，2012，98（2）：197-206.