基于口腔黏膜分泌物的快速检测HIV1/2型抗体方法建立及其临床应用研究

李高辉，康可人，黎锋，袁玉亮，王继华

感染个体进行 HIV 抗体的检测对 HIV 的诊断和控制至关重要，传统的血液检测法对医院的环境设施及相关医务人员水平的要求较高，也存在交叉感染的危险。研究表明，HIV 感染者的唾液或口腔黏膜渗出液中几乎不含 HIV 病毒，但含有抗 HIV 抗体，并且检出率高。这一发现为艾滋病检测提供了一个全新的发展方向[1-2]。在以口腔分泌物为样本的 HIV 抗体诊断试剂研发领域，虽然国内外曾有报道，但国内至今可成熟应用到临床检测的试剂非常少见。本研究通过工艺摸索及优化，建立了一种基于口腔黏膜渗出液样本检测 HIV1/2 型抗体的诊断方法（免疫分析法），为临床提供了适用于 HIV 抗体检测的安全、无创、快速诊断试剂。研制的检测试剂可广泛用于高危人群的流行病学调查和监测，对推进社区医疗和家庭 POCT（point of care testing）在传染病诊断领域的发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与仪器 氯金酸购自上海试五化学试剂有限公司；柠檬酸三钠购自广州化学试剂二厂；牛血清白蛋白（BSA）购自美国 Sigma 公司；HIV gp36、HIV gp41 基因重组抗原由本实验室制备；羊抗兔 IgG 多克隆抗体、鼠抗人 IgG 多克隆抗体、兔 IgG 均购自美国 Meridian Life Science 公司；人类免疫缺陷病毒（HIV1/2）抗体免疫印迹试剂盒为新加坡 MP 生物医学亚太有限公司产品[批准文号：国食药监械（进）字 2008 第 3403441 号；批号：AE9009]；人类免疫缺陷病毒抗体（HIV1/2）诊断试剂盒（血清血浆胶体金法）为广州万孚生物技术股份有限公司产品[批准文号：国食药监械（准）字 2010年 3400840 号；批号：W0620103C]；硝酸纤维素膜、Milli-Q Advantage A10超纯水仪购自美国 Millipore 公司；玻璃纤维购自上海尚卓过滤设备有限公司；NanoDrop 2000C 分光光度计为美国Thermo Fisher 公司产品；高速冷冻离心机为日本 Hitach 产品；接触式喷膜机为美国 Imagene Technology 公司产品；BHC-1300IIB2 生物安全柜为苏净安泰公司产品。

1.1.2 参考品

⑴标准参考盘（质控品）：Anti-HIV1/2 Combo Performance Panel PRZ207 由美国 SeraCare Life Science公司提供。由 15 支样品组成，其中 7 支 HIV-1 阳性参考品，7 支 HIV-2 阳性参考品，1 支阴性参考品（Lot：116839）。

⑵ HIV 抗体参考品（唾液快速试剂）：由中国药品生物制品检定所提供。由 46 支样品组成，其中 20 支阳性参考品，20 支阴性参考品，5 支灵敏度（最低检出限）参考品，1 支精密度参考品（Lot：20050415-01）。

⑶ HIV 抗体唾液检测企业参考品：由广州万孚生物技术股份有限公司提供。由 46 支样品组成，其中 20 支 HIV抗体阴性参考品，18 支 HIV-1 抗体阳性参考品，2 支HIV-2 抗体阳性参考品，5 支抗 HIV-1 型 gp160 抗体最低检出限参考品，1 支 HIV-1 型精密性样品（Lot：110715）。

1.1.3 临床样本来源 阳性样本 212 例，由广西壮族自治区疾病预防控制中心采集（时间跨度为 2008年 12月至2011年 5月期间 HIV 确诊患者），HIV 阳性样本均符合世界卫生组织艾滋病的监测诊断标准。阴性样本 500 例，为随机健康体检人群，由中国中医科学院广安门医院南区检验科及广州万孚生物技术股份有限公司采集。唾液采集时，用口腔拭子的采样端沿着受试者的上、下齿龈轻轻擦拭，翻转口腔拭子几次后，将拭子装入有处理液的样本试管内，采样端的两面紧贴试管壁刮擦若干次，从提取管中取出拭子，试管内样本即可用于测试。采集口腔黏膜渗出液样本同时平行采集上述人员的血液标本。

1.2 方法

1.2.1 试剂工艺体系建立及优化

1.2.1.1 固相化工艺体系的建立优化 0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液（pH 9.6）作为包被溶液稀释抗原、抗体。分别取 0.8、1.2、1.5 mg/ml 3 种浓度的 HIV gp41 和 gp36 基因重组抗原，在硝酸纤维膜上制备检测线（T 线）；分别取 1.0、1.5、2.0 mg/ml 3 种浓度的羊抗兔 IgG 多克隆抗体，在硝酸纤维膜上制备质控线（C 线）。选取最合适的浓度参数进行试剂的包被膜制备。

1.2.1.2 标记工艺体系建立及优化 将氯金酸配制成0.01% 水溶液，取 100 ml 加热至沸腾，边搅动边加入 1%柠檬酸三钠水溶液，继续加热煮沸 15 min，待溶液逐渐稳定成红色后，停止加热冷却至室温，用蒸馏水恢复至原体积。用 0.1 mol/L 碳酸钾调氯金酸溶液 pH 到 7.0～7.5，将鼠抗人 IgG 及兔 IgG 分别按 10 μg/ml 和 20 μg/ml 浓度蛋白溶液加入溶液中，混匀，静置 30 min，8500 r/min 离心50 min，沉淀用含 BSA 的缓冲液悬浮，洗涤 2～4 次，以除去未结合的蛋白质，将以上氯金酸颗粒结合物稀释至使用浓度，均匀涂布在玻璃纤维上制备蛋白标记垫，置于 30 ～40 ℃ 室内干燥 12 h。选取最合适的蛋白浓度参数进行标记垫的制备。

1.2.1.3 唾液缓冲体系的建立及优化 唾液缓冲体系在检测实现过程中除了提供缓冲外，能有效减少口腔分泌物杂蛋白或者活性酶的干扰反应。根据已有的实验基础，缓冲体系以 ISO/TR10217 标准人工唾液为配方进行优化，配制成含有氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫化钠、尿素及牛血清白蛋白的缓冲体系。

1.2.1.4 根据最佳的包被及标记工艺参数制备包被膜及标记垫。将包被膜、标记垫与样品垫粘贴成板，切成条，制备试剂条。

1.2.2 试剂性能评估 阳性参考盘符合率：分别用试剂检测阳性参考品，检测结果应符合参考品的要求；阴性参考盘符合率：分别用试剂检测阴性参考品，检测结果应符合参考品的要求；最低检出限（灵敏度）：分别用试剂检测最低检出限参考品，检测结果应符合参考品的检测要求；精密性：对 1 份精密性参考品平行测定 10 次，结果应符合要求，显色均一。

1.2.3 临床应用验证

1.2.3.1 用制备的 HIV1/2 口腔黏膜渗出液检测试剂（免疫层析法）和 HIV1/2 抗体（血清血浆）快速检测试剂分别平行检测 212 例 HIV 阳性患者并与免疫印迹法的结果比对，比较试剂符合率。

1.2.3.2 用制备的 HIV1/2 口腔黏膜渗出液检测试剂（免疫层析法）和 HIV1/2 抗体（血清血浆）快速检测试剂分别平行检测 500 例 HIV 随机阴性人群口腔黏膜渗出液和血液样本；进行试剂符合率比较。

1.3 统计学处理

应用 Microsoft Excel 2000 软件对数据记录、处理和作图。配对卡方检验采用 SPSS 软件进行，P ＜ 0.05 为有统计学差异。

2 结果

2.1 试剂工艺确定

通过梯度实验，最终选取浓度为 1.5 mg/ml 的 HIV gp41 蛋白和 gp36 蛋白包被硝酸纤维素膜制备 T 线；2.0 mg/ml 浓度的羊抗兔 IgG 多克隆抗体包被硝酸纤维膜上制备 C 线。选取 20% 稀释比例浓度稀释鼠抗人 IgG 及兔 IgG 的氯金酸结合物，制备标记垫，将硝酸纤维膜与标记垫分别置于温度 30℃ ± 5℃，湿度 10%～30% 的环境下干燥 12 h。组装成大板，用切条机切成 4.0 mm 的条，装入外盒，制成免疫层析检测试剂成品。

2.2 试剂性能评估

用制备的 HIV1/2 口腔黏膜渗出液检测试剂分别检测国际参考盘 Anti-HIV1/2 Combo Performance Panel、国家HIV 抗体参考品和企业参考品，检测结果表明研制试剂的灵敏度、特异性、精密度三项指标均符合要求。国际参考盘中的 HIV-1 型及 2 型共 14 支阳性样本检测均为阳性结果，符合率达到 100%。国家参考盘中的 HIV-1 型的 18 支阳性样本及 2 支 HIV-2 型样本检测结果均为阳性结果。特异性指标结果显示，试剂检测国家参考盘和企业参考盘的阴性参考品共 40 支，无假阳出现，达到标准品对特异性指标的要求，阴性符合率为 100%（20/20），符合标准要求的大于 90%（18/20）。结果见表 1。

2.3 临床样品唾液快速检测的结果

采用研制的 HIV1/2 口腔黏膜渗出液检测试剂和对照HIV 血清血浆检测试剂分别检测 712 例样本。临床结果显示，口腔黏膜渗出液检测试剂与对照 HIV 血清血浆检测试剂阳性符合率为 210/213 = 98.59%；阴性符合率为499/499 = 100%；总符合率为（210 + 499）/（213 + 499）=99.58%。两种方法比较，无显著差异性（P ＞ 0.05）。212 例经免疫印迹检测确认为阳性结果的样本中，研制试剂检出210 例，与免疫印迹检测试剂阳性相符率为 210/212 =99.06%。在对比试验中发现，研制的 HIV1/2 口腔黏膜渗出液检测试剂在临床检测结果比以血液为样本的快速筛查试剂总符合率高，参照免疫印迹法的结果比对发现，对某些低值阳性样本研制的口腔黏膜渗出液检测试剂较血液快速检测试剂更为灵敏（数据未公布），这与唾液检测系统的工艺体系直接相关，可见以口腔黏膜渗出液为样本的检测模式在应用中更为方便、快捷、准确。

表1 参考盘的检测结果

3 讨论

人体口腔分泌的唾液中主要成分为水，其次含有少量唾液淀粉酶、黏多糖、黏蛋白及某些无机物。研究表明，唾液成分变化同样反映疾病及健康状况，已逐渐成为取代血液或尿液的检测样本，在医学诊断领域被广泛研究和运用[3-6]。

HIV 抗体检测，是艾滋病病毒检测一直沿用的基本检测方法[1]，包括酶联免疫吸附法、侧向免疫层析法和免疫印迹法。但成熟的抗体筛查试剂仍然以血清、血浆及全血样本为主，唾液或口腔黏膜渗出液不多见。以口腔黏膜渗出液为样本的 HIV 抗体快速诊断试剂目前国内未见有厂家研制及规模化生产，全球各大诊断试剂厂家在 HIV 检测领域也颇为关注[7]。本研究制备的口腔黏膜渗出液 HIV1/2 型抗体检测试剂是将抗原抗体的反应与侧向层析原理相结合，通过实现固相化工艺及蛋白标记工艺的突破，实现 HIV 抗体快速检测技术的又一次提升。本实验室研发的 HIV 口腔黏膜渗出液检测试剂，通过检测不同来源的参考盘，验证其灵敏度、特异性、精密度均符合要求。检测 712 份临床样本的数据表明，研制的试剂与商品化的 HIV 抗体检测试剂有较高的总符合率，达到 99.58%。与免疫印迹法比较，两者阳性符合率为 99.06%。

综上所述，本研究成功建立了以口腔黏膜分泌物为检测样本的非侵入性 HIV 快速检测方法及试剂，研制的试剂盒作为一种快速、简便、准确、无创的诊断方法适用于大规模人群的现场检测及家庭自测，尤其适用于医疗条件有限、采血困难的边远地区及儿童、肥胖者、静脉萎缩者等不易于静脉采血人群的检测，为艾滋病的有效防控及治疗评价提供了更为快捷、便利的新手段和工具。

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