不同浓度脂联素对HepG2细胞内甘油三酯含量的影响及其机制

阳 琰，邓华聪，龙 健，苏艳新，瞿 华，胡振平

（重庆医科大学附属第一医院内分泌科，重庆 400016））

高甘油三酯（hypertriglyceridemia，HTG）所致的脂毒性近年来已引起人们的高度重视。HTG能抑制胰岛素的信号传递，从而引起并加重胰岛素抵抗（insulin resistance，IR），使胰岛素的生物效应降低，又能引起葡萄糖刺激的胰岛素分泌障碍，并导致β细胞凋亡，使胰岛素分泌减少［1］，并与心血管病密切相关。人脂联素是脂肪细胞分泌的一种特异性蛋白质，载脂蛋白A5（apolipoprotein A5，apoA5）是目前所知唯一能够降低血浆甘油三酯（triglyceride，TG）的载脂蛋白，均与TG水平密切相关［2－4］。但是，脂联素与apoA5和TG之间是否呈剂量依赖关系，目前国内外未见相关研究报道。因此，本研究拟通过观察比较不同浓度脂联素对HepG2细胞内apoA5mRNA和蛋白表达水平及TG含量的影响，探讨脂联素与TG之间的剂量依赖关系，以及脂联素降低TG的可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂 HepG2细胞购自北京协和医院细胞库。人脂联素蛋白购自美国R＆D公司。DMEM购于Gibco－BRL公司，胎牛血清购自杭州四季清公司。Trizol regent、逆转录试剂盒和Taq酶均购自Takara公司。PCR引物由上海基康生物技术有限公司合成。apoA5抗体（ab36974）购自Santacruz公司。二抗和细胞蛋白抽提试剂盒均购自凯基生物技术研究所。TG测定试剂盒购自北京中生北控公司。二甲亚砜（DMSO）购自上海博耀生物科技有限公司。

1.2 HepG2细胞培养与分组用含10%胎牛血清的DMEM培养HepG2细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，0.25%胰酶消化，每2～3d更换1次培养基并传代。用不同浓度脂联素（0、12.5、25.0、50.0mg·L－1）作用 HepG2 细胞24h，取生长良好的HepG2细胞（80%），胰酶消化后，调节细胞密度至2×105mL－1，接种于6孔培养板中传代培养，继续培养至细胞贴壁，显微镜下观察细胞密度达5000个细胞／孔，PBS漂洗2次；改用无血清的DMEM培养，分为4组（每组取3个复孔，所测结果取3孔平均值）：对照组，无脂联素；低剂量组，12.5mg·L－1脂联素；中剂量组，25.0mg·L－1脂联素；高剂量组，50.0mg·L－1脂联素。

1.3 酶法检测各组细胞内TG含量 吸去6孔板中培养基，加入预冷PBS缓冲液2mL洗2次，每次轻柔振摇数次以尽量去除培养液。细胞洗涤后，加入适量PBS缓冲液，用细胞刮将贴壁上细胞刮下，转至新的预冷的离心管中，1000r·min－1、4℃离心10min，弃去上清液，加入200μL异丙醇以抽提细胞中的脂质。－70℃／37℃反复冻融数次，在显微镜下观察，见细胞全部碎裂，9000r·min－1离心10min，将上清转移到另一清洁1.5mL离心管中，加入1mol·L－1的 NaOH 20μL，溶解管底蛋白沉淀12h以上，BCA法测定蛋白含量。加入TG测定试剂，37℃孵育30min。读取吸光度（A）值，根据标准品计算TG含量，并用TG含量除以蛋白含量，计算出细胞内TG含量（单位：mg·g－1）。

1.4 实时荧光定量RT－PCR法检测apoA5 mRNA水平 提取细胞总RNA，以总RNA 1.5μg为逆转录反应模板，进行逆转录总的反应体积为20μL。人apoa5引物正义：5′－CATCCAGCCTCCTGCGACTC－3′；反义：5′－TCCCTACTCCCTCACCCTTG－3′。GAPDH引物正义：5′－TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG－3′；反义：5′－TGCTGTCACCTTCACCGTTC－3′。反应体系总体积为25μL，Sterile water 16.3μL，10×Taq buffer 2.5μL，apoa5 引物1（10μmol·L－1）0.75μL，apoa5引物2（10μmol·L－1）0.75μL，MgCl2（25mmol·L－1）1.5μL，4dNTP（2.5mmol·L－1）2μL，cDNA 1μL，Taq酶（5U）0.2μL。条件：95℃、5min，95℃、30s，退火温度61℃、30s，72℃、延长20s，循环37次，72℃延长10min。以待测样品目的基因的拷贝数平均值除以该样品内参基因的拷贝数平均值，得到目的基因的相对含量。样品中模板的拷贝数，可由SDS软件通过所得到的Ct值从标准曲线上计算得到。

1.5 Western blotting法检测apoA5蛋白水平收集经上述处理后的细胞，取30μg蛋白质加样，经12%PAGE电泳后转移到PVDF膜上，取抗apoA5一抗稀释度为1∶2000，二抗稀释度为1∶1000，碱性磷酸酶法显色，曝光。

1.6 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件包进行统计分析，apoA5mRNA水平和TG含量以表示，各组细胞内apoA5mRNA和蛋白表达水平及TG含量为正态分布资料，应用随机区组设计资料的方差分析及两两比较分析各组之间的差异。

2 结 果

2.1 各组HepG2细胞内apoA5mRNA和蛋白表达水平 与对照组比较，脂联素各组HepG2细胞内apoA5mRNA和蛋白表达水平均明显增加（P＜0.05）；与低剂量脂联素组比较，中、高剂量脂联素组HepG2细胞中apoA5mRNA和蛋白表达水平均明显增加（P＜0.05）；与中剂量脂联素组比较，高剂量组HepG2细胞内apoA5mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），但有增加趋势。见表1和图1。

2.2 各组HepG2细胞内TG含量 与对照组比较，脂联素各组HepG2细胞内TG含量均明显降低（P＜0.05）；与低剂量脂联素组比较，中、高剂量脂联素组HepG2细胞内TG含量均明显降低（P＜0.05）；但高剂量组与中剂量组TG含量比较差异无统计学意义（P＞0.05），但有降低趋势。见表1。

表1 各组HepG2细胞中apoA5mRNA表达及TG含量比较Tab.1 Comparisons of apoA5mRNA expressions and TG contents in HepG2cells between various groups （）

表1 各组HepG2细胞中apoA5mRNA表达及TG含量比较Tab.1 Comparisons of apoA5mRNA expressions and TG contents in HepG2cells between various groups （）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vslow dose adiponectin group.

Group apoA5mRNA TG（mg·g－1）Control 1.10±0.18 423±57 Adiponectin Low dose 1.51±0.32＊ 339±42＊Middle dose 2.58±0.41＊△ 235±31＊△High dose 3.15±0.67＊△ 228±29＊△

图1 各组HepG2细胞中apoA5蛋白表达比较Fig.1 Comparisons of apoA5protein expressions in HepG2 cells between various groups

3 讨 论

研究［5］认为：HTG与2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的发生发展有密切联系，其机制可能为：① HTG血症引起IR，影响胰岛β细胞分泌功能；②HTG血症时游离脂肪酸（FFA）含量增高，FFA在β细胞内氧化代谢增强，抑制葡萄糖的氧化代谢，从而引起葡萄糖刺激胰岛素分泌障碍，从而导致T2DM发生。2012年，欧洲心脏病学会（ESC）和欧洲动脉粥样硬化学会（EAS）联合发布的血脂异常管理指南明确指出：富含HTG的脂蛋白是心血管疾病的高危因素［6］。因此，HTG在脂毒性危害中占据非常重要的地位，对TG代谢研究势必成为学术研究热点。

脂联素是由脂肪细胞分泌的一种激素蛋白，已有资料显示脂联素在血脂代谢中发挥重要作用。人脂联素由244个氨基酸组成，ELISA法测定正常人血浆脂联素浓度为5～30mg·L－1［7］。目前，流行病学资料和临床研究［8］显示：脂联素与IR、TG呈负相关关系，与高密度脂蛋白－胆固醇（HDL－C）呈正相关关系。最近研究［9－10］表明：脂联素主要通过改变关键酶（脂蛋白酯酶、肝酯酶）的浓度及活性调节富含TG的脂蛋白的代谢。有研究［11］发现：血清脂联素水平与TG代谢密切相关，并且发现T2DM并发HTG患者血清脂联素水平较单纯T2DM患者明显降低。apoA5特异表达于肝脏，肝脏apoA5表达降低可能是发生HTG的关键因子之一［12－13］。脂联素和apoA5均与 TG 代谢密切相关［14］，但是关于脂联素在肝脏调节TG是否与apoA5表达有关，目前国内外未见相关研究报道。本研究结果显示：脂联素能升高HepG2细胞内apoA5mRNA和蛋白表达及降低TG含量，并呈剂量依赖关系，当脂联素浓度达到25mg·L－1，其升高apoA5表达及降低TG作用达到最大，与50mg·L－1脂联素比较差异均无统计学意义，说明脂联素浓度处于生理浓度高限时可以明显降低TG水平，这一作用可能与其能明显升高apoA5mRNA和蛋白表达水平有关。

综上所述，脂联素能降低HepG2细胞内TG含量，两者之间具有剂量依赖关系，即随着脂联素浓度逐渐增加，apoA5mRNA和蛋白表达水平逐渐增加，TG水平逐渐降低。本课题组前期人体实验［15］结果显示：血浆脂联素水平与apoA5呈正相关关系，与TG呈负相关关系，故本文作者认为脂联素降低肝脏TG可能是通过增加apoA5表达而实现，但其具体机制有待进一步研究探索。

［1］Kashyap S，Belfort R，Gastaldelli A，et a1.A sustained increase in plasma free fatty acids impairs insulin secretion in nondiabetic subjects genetically predisposed to develop type 2 diabetes［J］.Diabetes，2003，52（10）：2461－2474.

［2］Cook JR，Semple RK.Hypoadiponectinemia cause or consequence of human “insulin resistance”［J］.J Clin Endocrinol Metab，2010，95（4）：1544－1554.

［3］Lin J，Fang DZ，Du J，et al.Elevated levels of triglyceride and triglyceride－rich lipoprotein triglyceride induced by a highcarbohydrate diet is associated with polymorphisms of APOA5－1131T＞C and APOC3－482C＞T in Chinese healthy young adults［J］.Ann Nutr Metab，2011，58（2）：150－157.

［4］Evans D，Aberle J，Beil FU.Resequencing the apolipoprotein A5（APOA5）gene in patients with various forms of hypertriglyceridemia ［J］.Atherosclerosis，2011，219（2）：715－720.

［5］Anger GJ，Piquette－Miller M.Impact of hyperlipidemia on plasma protein binding and hepatic drug transporter and metabolic enzyme regulation in a rat model of gestational diabetes［J］.J Pharmacol Exp Ther，2010，334（1）：21－32.

［6］赵水平.甘油三酯在动脉粥样硬化性疾病中的地位及治疗措施［N］.社区用药指导·循环，第11版，2011年9月23日.

［7］Vu V，Liu Y，Sen S，et al.Delivery of adiponectin gene to skeletal muscle using ultrasound targeted microbubbles improves insulin sensitivity and whole body glucose homeostasis［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2012Nov 6.［Epub ahead of print］

［8］Nishida M，Funahashi T，Shimomura I.Pathophysiological significance of adiponectin ［J］.Med Mol Morphol，2007，40（2）：55－67.

［9］Gardener H，Crisby M，Sjoberg C，et al.Serum adiponectin in relation to race－ethnicity and vascular risk factors in the Northern Manhattan Study［J］.Metab Syndr Relat Disord，2012Nov 5.［Epub ahead of print］

［10］Liu Q，Yuan B，Lo KA，et al.Adiponectin regulates expression of hepatic genes critical for glucose and lipid metabolism［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（36）：14568－14573.

［11］吴文君，卜瑞芳，刘国萍，等.2型糖尿病合并高甘油三酯血症患者血清脂联素水平与脂联素基因多态性分析 ［J］.中国糖尿病杂志，2008，16（7）：402－404.

［12］Sa′nchez－Moreno C，Ordova′TM，Smith CE，et al.APOA5 gene variation interacts with dietary fat intake to modulate obesity and circulating triglycerides in a mediterranean population［J］.J Nutr，2011，141（3）：380－385.

［13］Zheng XY，Zhao SP，Yu BL，et al.Apolipoprotein A5 internalized by human adipocytes modulates cellular triglyceride conten［J］.tBiol Chem，2012，393（3）：161－167.

［14］Hadarits F，Kisfali P，Mohás M，et al.Common functional variants of APOA5and GCKR accumulate gradually in association with triglyceride increase in metabolic syndrome patients［J］.Mol Biol Rep，2012，39（2）：1949－1955.

［15］阳 琰，邓华聪，龙 健，等.空腹血糖受损与糖耐量减低者血浆载脂蛋白A5、胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能的比较 ［J］.解放军医学杂志，2011，36（7）：725－728.