全反式维甲酸对人肝癌SMMC－7721细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其分子机制

李海燕，曹励民，贺红艳，黄凤霞

（西安医学院医学技术系，陕西 西安 710021）

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其复发、转移影响了肝癌患者的预后。抑制肝癌复发、转移可延长肝癌患者的生存期，改善其生活质量。全反式维甲酸（all－trans retinoic acid，ATRA）为维生素A的氧化代谢产物，是常用的诱导分化剂。近年研究［1－3］发现：ATRA 及其衍生物除广泛应用于白血病的治疗外，体内外实验还证实其可促进多种实体瘤细胞的分化，明显抑制乳腺癌、肝癌和胃癌细胞等的侵袭和转移。ATRA诱导分化对肿瘤细胞的侵袭、转移可能具有一定的预防和治疗作用，但具体的分子机制尚不十分清楚。因此本文作者探讨ATRA对人肝癌细胞株SMMC－7721增殖、迁移和侵袭能力的影响及其分子机制，旨在为ATRA用于肝癌的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂 人肝癌细胞株SMMC－7721引自中国科学院上海细胞生物研究所；ATRA购自Sigma公司，用二甲基亚矾（DMSO）配制浓度为10mmol·L－1的存储液，分装后于－20℃避光保存。RPMI 1640培养基（Gibco公司），小牛血清（杭州四季青生物工程公司），Transwell小室（3428型，美国 Coming公司），Matrigel（5g·L－1），美国BD公司），Total RNA Kit（美国 Omega 公司），Fluorophore Sybr Green（Netherlands公司）。BCA蛋白定量检测试剂盒（美国Pierce公司），ECL发光检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），胰蛋白酶（Amresco公司），基质金属蛋白酶9（MMP－9）和α－tublin一抗（美国ABCAM公司）。

1.2 细胞培养 人肝癌细胞株SMMC－7721培养于含有10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，在5%CO2浓度、饱和湿度及37℃孵育箱中培养，3～4d传代1次，选取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 实验分组将处于对数生长期的SMMC－7721细胞分为空白对照组和10、20和40μmol·L－1ATRA组。

1.4 细胞增殖实验 收集处于对数期生长的肿瘤细胞，调整细胞悬液密度，接种于96孔板，每孔200μL，5000个细胞／孔，孵育24h使细胞贴壁。细胞贴壁后弃上清，更换新鲜的培养液，180μL／孔，并加入20μL的各浓度药液，含ATRA分别为10、20和40μmol·L－1，空白对照仅加入20μL培养基，每组6个复孔，置摇床上低速振荡混匀，培养箱继续培养24h后加入20μL／孔 MTS／PMS溶液，MTS的终质量浓度为333μg·L－1，PMS的终浓度为25μmol·L－1，继续培养4h，然后置摇床上低速振荡10min，测量各孔在490nm处的吸光度（A）值。实验重复3次，以增殖率表示药物对细胞增殖的影响。增殖率 ＝ （各组所得到的A值／空白对照组A值）×100%。

1.5 划痕愈合法测定细胞迁移能力 将2×106个SMMC－7721细胞接种在6孔板，培养至90%融合状态，无血清培养基洗3次，换无血清培养基饥饿24h；用10μL移液器的枪头沿培养板底部做“1”字划痕，划痕时要以直尺定位。无血清培养基洗3次，换新鲜无血清培养基，加入ATRA调节浓度为10、20和40μmol·L－1。37℃、5%CO2培养箱中培养24h后，倒置显微镜下在划痕同一位置观察并拍照，使用Image J软件测量并统计划痕区宽度。对照组与实验组均设3个平行样本。

1.6 Transwell小室实验测定细胞侵袭能力 将Transwell放入24孔板内，Matrigel与无血清培养基1∶9配制，Transwell上层铺50μL稀释的Matrigel，37℃过夜至 Matrigel胶凝固，种植细胞，每孔细胞数量为1×105个，无血清培养基300μL，加入ATRA，调节药物浓度为10、20和40μmol·L－1，置于细胞培养箱孵育。24h后分别取出小室，以PBS清洗3次，用棉签小心刮除滤膜上面的细胞，膜下面细胞用甲醛固定，并以1%结晶紫染色15min，PBS洗3次。倒置显微镜下高倍镜观察并拍照，Image J软件计数细胞数值，结果以细胞数表示。

1.7 Real－time PCR 以10、20和40μmol·L－1ATRA处理细胞，在24h以Total RNA Kit提取细胞总RNA，按试剂盒要求，逆转录合成cDNA。MMP－9基因引物及内参GAPDH基因引物设计及反应参数参考相关文献［4－5］，引物经上海生物工程有限公司鉴定其合理性后生成。MMP－9，F：5′－TTCCCCTTCACTTTCCTGGGTA－3′，R：5′－CGCCACGAGGAACAAACTGTAT－3′；GAPDH，F：5′－GCACCGTCAAGGCTGAGAAC－3′，R：5′－TGGTGAAGACGCCAGTGGA－3′。

使用仪器CFD3120MiniOpticon Detector（BIO－RAD，California，USA）进 行 Real－time PCR，按照仪器使用说明书及其软件进行相应的设置。每个循环末自动记录荧光强度，结果应用GraphPad.Prism.v5.0.软件进行数据分析，相对表达量采用2－ΔΔCT方法计算，－ ΔΔCT ＝－（ΔCT0q－ΔCT0cb）［6］。

1.8 Western blotting 以10、20和40μmol·L－1ATRA处理细胞，在24h收集细胞，PBS洗3次，加入细胞裂解液，冰上裂解提细胞总蛋白。蛋白质定量变性后上样，SDS－PAGE电泳后转PVDF膜，半干标准转膜90min。将转有蛋白条带的膜常规封闭、洗膜后分别与特异性一抗4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次5min，二抗室温孵育1h，TBST洗3次，每次5min，化学发光剂检测蛋白质印迹，薄层扫描仪测定印迹区带的A值。观察各条带深浅变化并加以分析，α－tublin作为对照。实验重复3次。结果在凝胶成像仪上照相并使用Bio－Rad公司Quantity One分析软件测量条带灰度值，目的条带与α－tublin条带灰度值比值即为该目的蛋白的相对表达量。

1.9 统计学分析 采用SPSS 15.0统计学软件进行统计分析，增殖率以百分比表示，划痕距离和穿膜细胞数以表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 ATRA作用下人肝癌SMMC－7721细胞的增殖能力 空白对照组与10、20和40μmol·L－1ATRA组SMMC－7721细胞的增殖率分别为94%、82%、60%和34%，与空白对照组比较，20和40μmol·L－1ATRA组SMMC－7721细胞的增殖率明显降低（P＜0.01）。

2.2 ATRA作用下人肝癌SMMC－7721细胞的迁移能力 空白对照组SMMC－7721细胞在0h划痕距离为（186.00±0.56）μm，在24h划痕距离为（35.00±0.41）μm，24h细胞划痕距离较0h明显减少（P＜0.05），表明 SMMC－7721细胞具有较强的迁移能力。与空白对照组比较，10、20和40μmol·L－1ATRA组细胞在0h划痕距离较一致；而处理24h后，10、20和40μmol·L－1ATRA组的划痕距离分别为（37.00±0.53）、（98.00±0.62）和（107.00±0.81）μm，与空白对照组比较，10μmol·L－1ATRA组划痕距离无明显变化，而20和40μmol·L－1ATRA组划痕距离明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1（封二）。

2.3 ATRA作用下人肝癌SMMC－7721细胞的侵袭能力 Transwell实验结果显示：10、20和40μmol·L－1ATRA组SMMC－7721细胞处理24h后，穿膜细胞数分别为（45.30±0.52）、（32.80±0.21）和（21.50±0.64）个，较空白对照组［（63.60±0.45）个］明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2（插页一）。

2.4 ATRA作用下SMMC－7721细胞中MMP－9 mRNA和蛋白的表达 Real－time PCR结果：空白对照组与10、20和40μmol·L－1ATRA组SMMC－7721细胞处理24h后，MMP－9mRNA的相对表达量分别为 0.18、0.12、0.07和0.03，20和40μmol·L－1ATRA组MMP－9mRNA表达水平明显低于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；Western blotting结果：空白对照组与10、20和40μmol·L－1ATRA组SMMC－7721细胞处理24h后，MMP－9蛋白表达相对值分别为0.98、0.84、0.63和0.45，20和40μmol·L－1ATRA组蛋白表达相对值较空白对照组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

图3 ATRA作用下SMMC－7721细胞中 MMP－9蛋白表达Fig.3 The MMP－9protein expression in SMMC－77211 cells after treated with ATRA

3 讨 论

恶性肿瘤的侵袭和转移是肿瘤患者死亡的主要原因。寻找有效的抗肿瘤转移药物一直是药物研发的热点［7－9］。阻断肿瘤细胞黏附、侵袭和迁移过程的各环节均有可能抑制肿瘤的转移。

ATRA作为诱导分化剂在急性早幼粒细胞白血病中的应用取得了令人鼓舞的成效，这促使人们考虑其应用于其他实体瘤的治疗是否依然有效。近年来，很多研究者已从细胞学、动物实验以及临床试验的角度对胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌等恶性肿瘤应用ATRA进行诱导、分化的治疗。初步研究的结果显示：ATRA对恶性肿瘤细胞具有诱导分化、抑制增殖和诱导凋亡等作用，同时在抑制实体肿瘤的侵袭转移中也逐渐显示其作用［10－12］。

本研究结果显示：ATRA可以呈剂量依赖性抑制SMMC－7721细胞的增殖，20.0μmol·L－1以上摩尔浓度可以抑制肿瘤细胞的增殖，这与刘子文等［13］的研究结果相一致；表明其可呈剂量依赖性抑制SMMC－7721细胞的迁移能力。

划痕愈合实验、Transwell小室细胞侵袭实验是目前常用的体外研究肿瘤细胞侵袭行为的经典方法。本研究中划痕愈合实验结果显示：空白对照组细胞具有很强的迁移能力，划痕后24h，划痕处大部分愈合。而在ATRA组，作用于SMMC－7721细胞后，其迁移能力却非常弱，对比划痕0h的图片结果，经过24h的培养，划痕处未见愈合。Transwell小室细胞侵袭实验结果表明：随着ATRA作用于SMMC－7721细胞剂量的增加、时间的延长，SMMC－7721细胞的穿膜数明显低于空白对照组。提示ATRA可抑制SMMC－7721细胞的侵袭能力，这与汪思应等［14］和李冰等［15］的研究结果一致。

MMP－9是相对分子质量最大的基质金属酶，主要降解和破坏Ⅳ型胶原。Ⅳ型胶原是阻碍肿瘤侵袭转移的关键屏障基底膜的主要成分，因此，MMP－9被认为是肿瘤局部侵袭和转移的重要分子。MMP－9在肿瘤侵袭和转移中发挥的重要作用，还包括调节细胞间的黏附和促进肿瘤血管的生成。本研究结果显示：ATRA无论从mRNA水平还是蛋白水平均呈剂量依赖性下调 MMP－9的表达。

本研究初步证明了ATRA能够抑制人肝癌SMMC－7721细胞的增殖和侵袭能力，其对肝癌细胞侵袭能力的抑制可能与下调MMP－9有关，进一步的分子机制尚需深入研究。

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