藏羚羊与藏绵羊小肠嗜银细胞的观测

韩 梅

(青海省藏医药研究院药物研究所，青海 西宁 810003)

藏羚羊俗称独角羊，青藏高原土生物种，属偶蹄目、牛科、藏羚属，系青藏高原特有物种，主要分布在西藏和青海的大部分以及新疆南缘、四川西北隅和甘南西南的部分地区。它们的栖息高度在3700m～5500m，尤以4500m～5500m的高原无人区比较常见，如高寒草甸、高寒草原和高寒荒漠等环境［1］。藏羚羊是长期在极高海拔生活，在长达7个月左右的牧草枯草期，尤其是冬季，草原经常被大雪覆盖，导致藏羚羊所能获取到的食物极其有限但就是在这样恶劣的环境下，藏羚羊依然顽强的生活，这可能与它的消化和吸收能力有着密切的联系。据曹俊虎［2］等对藏羚羊冷季干物质的消化效率的实验研究表明，藏羚羊在枯草期对禾本科牧草上部(含种子)、禾本科茎杆及禾本科牧草、混合牧草干物质的消化率分别为72.56%、65.60%和70.86%，对比赵新全［3］、刘金祥［4］、Merkel［5］等多人在野生藏绵羊、高山草原放牧绵羊、公山羊等反刍动物对干物质的消化率的研究，发现藏羚羊冬季对牧草的消化率比以上研究所测得对干物质的消化率(40% ～64%)相对较高，这表明在严酷的生境下，藏羚羊通过对牧草干物质较高的消化率为其生存提供了一定的条件。消化道是脊椎动物体内最大、最复杂的内分泌器官［6］。嗜银细胞属于内分泌细胞，其主要分泌5－羟色胺(5－HT)［7］，它具有刺激平滑肌收缩、血管扩张及调节胃肠消化的功能。那么，藏羚羊在高寒低氧、食物匮乏的环境中能够生存，其消化系统尤其是调节小肠消化功能的嗜银细胞有何特征呢?为了保护和发展这一世界珍稀物种，本实验采用组织化学的方法对藏羚羊和生活在同一海拔高度的藏绵羊的小肠嗜银细胞的分布和数量进行了比较研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物的取材和固定

经国家林业局批准(林护批字［2009］194号)，在青海省可可西里自然保护区(海拔4 300 m)捕捉健康藏羚羊和藏绵羊各5只，颈总动脉采血后放血处死，就地迅速解剖，取十二指肠、空肠和回肠中段各2 cm左右快速置入4%多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH7.4)固定液，摇匀，固定48 h。

1.2 石蜡切片制作

1.2.1 脱水透明包埋:固定好的组织分别依次经过50%酒精24 h→70%酒精24 h→80%酒精18 h→95%酒精18 h→100%酒精6 h→酒精﹕二甲苯1 h→二甲苯I 10～20 min(二甲苯的时间长短不同，组织变透亮为宜)→二甲苯﹕蜡30 min→蜡Ⅰ30 min→蜡Ⅱ30 min。包埋时先预热铝板、铝条、镊子等工具，先倒蜡后放组织。

1.2.2 切片:制作横断面连续切片，每隔10张取1张，片厚 3 μm。

1.3 硝酸银染色

1.3.1 试剂的配制:(1)1%硝酸银水溶液:硝酸银0.1 g，加入10 mL双蒸水，混合均匀即可。(2)0.2 mol/L醋酸钠缓冲液的配制:A液:99% ～100%冰醋酸(比重:1.050～1.054)2.875 mL，加蒸馏水至 250 mL。B 液:醋酸钠 6.8 g，加蒸馏水至250 mL。A液B液混合即可得0.2 mol/L醋酸钠缓冲液。(3)硝酸银液:取1%硝酸银水溶液3 mL，0.2 mol/L醋酸钠缓冲液的配制10 mL，加双蒸水至100 mL混匀。(4)还原液:对苯二酚1 g，亚硫酸钠2.5 g，加水至100 mL。

1.3.2 染色步骤:切片按常规脱蜡、复水，然后放入60℃硝酸银液4 h，双蒸水洗2次，放入45℃还原液35 min，蒸流水洗3次洗去多余的染液，放入5%硫代硫酸钠2 min，双蒸水洗2次，脱水、透明、中性树胶封片。

1.4 检测指标和方法

光镜下观察嗜银细胞的形态分布;嗜银细胞的计数是每只动物各段小肠分别统计5张切片横断面全层的嗜银细胞数，并用Moditec照相处理软件，计算单位面积内的嗜银细胞数。

1.5 统计分析

数据处理采用SPSS.V13.0软件进行方差分析和显著性检验。结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 藏羚羊与藏绵羊小肠嗜银细胞的形态与分布

嗜银细胞经Grimelins染色后，细胞质被染成棕褐色，细胞核不着色，胞浆内颗粒丰富。细胞形态有梭形、蝌蚪形、圆形和不规则形，主要分布在黏膜层，尤其在靠近黏膜肌的小肠腺上皮之间，绒毛上皮之间和绒毛轴心中也有零星分布。并且藏羚羊嗜银细胞在回肠最多，十二指肠次之，空肠较少，藏绵羊嗜银细胞在十二指肠最多，回肠次之，空肠较少。

图1 藏羚羊(A)和藏绵羊(B)十二指肠的嗜银细胞(箭头所示)Grimelins染色40×

2.2 藏羚羊与藏绵羊小肠嗜银细胞的数量

由下表可知，藏羚羊小肠的嗜银细胞数少于藏绵羊小肠的嗜银细胞数(P＞0.05)，其中藏羚羊十二指肠的嗜银细胞数量比藏绵羊的减少38.38%(P ＜0.05)，而藏羚羊空肠和回肠的嗜银细胞数比藏绵羊空肠和回肠的多31.76%(P ＞0.05)，12.93%(P ＞0.05)。

同一物种不同肠段的嗜银细胞数量比较，藏羚羊嗜银细胞数量在回肠最多，十二指肠次之，空肠最少，其中回肠分别较十二指肠、空肠的多 32.36%(P ＜0.05)、43.11%(P ＜0.05)，十二指肠与空肠间差异不显著(P ＞0.05)。藏绵羊嗜银细胞数在十二指肠最多，回肠次之，空肠较少，其中十二脂肠分别较空肠、回肠的多131.22%(P ＜0.05)、38.48%(P ＞0.05)。

表1 藏羚羊和藏绵羊小肠嗜银细胞的数量 (cells/mm2)

图2 藏羚羊与藏绵羊小肠嗜银细胞数量的比较

3 讨论

嗜银细胞是消化道内的一类内分泌细胞，主要分泌5－HT，5－HT能刺激胃肠黏膜分泌，平滑肌收缩和血管扩张，对消化功能有很强的调节功能。5－HT在5－HT受体的介导下刺激初级传入神经元，然后该神经元与肌间神经丛中与上行、下行中间神经元形成突触，从而产生局部的兴奋和抑制作用。上行性中间神经元通过释放P物质和乙酰胆碱作用于兴奋性运动神经元，引起环行肌收缩;下行性中间神经元通过释放5－HT、血管活性肠肽、生长抑素、速激肽、一氧化氮、血管活性肠肽等神经递质作用于抑制性运动神经元而使环行肌松弛。由此形成了胃肠道由近端向远端的蠕动反射［8］。肠道的运动与其内容物的传输密切相关。肠道的蠕动速度快，则对肠内容物的传输速度也快，反之则慢。有研究发现［9］，在静脉内注射5－HT或给予选择性5－HT再摄取抑制剂后，小肠蠕动增强，推进速度加快，内容物通过回盲部的时间缩短;给予大鼠腹膜内注射5－HT能显著增强其结肠的推进性运动，使肠内容物由近端向远端结肠移动，快速至直肠排出，甚至可以导致腹泻。本实验的研究结果表明，藏羚羊小肠内嗜银细胞数量少于藏绵羊，尤其是十二指肠的嗜银细胞数量显著少于藏绵羊，较少的嗜银细胞使得其分泌少量的5－TH，后者所激活的一级神经元数量少，从而导致小肠蠕动较弱，肠道由近端向远端的推进运动缓慢，这个过程使得藏羚羊所采的食物在小肠特别是在十二指肠的存留时间相对藏绵羊要长，因此其对食物的消化时间要长，消化和吸收的效率更高，这在很大程度上促进了藏羚羊对食物的利用效率。

有关哺乳动物小肠嗜银细胞的分布形式有2种［10］，第一种:内分泌细胞数量在十二指肠较多，向尾端有降低的趋势，形成一条从小肠头端向尾端倾斜的分布密度曲线，如猪、猫、马、豚鼠;第二种:内分泌细胞在小肠中段数量极少，而在头尾两端即十二指肠和回肠数量较多，形成一个“U”形的密度分布曲线，如大鼠。本研究中藏羚羊和藏绵羊小肠嗜银细胞的分布形式与第二种一致。

［1］Nuss HB，Houser SR.Sodium －calcium exchange－mediated contractions in feline ventricular myocytes［J］.Am J Physiol 1992.2634 P(2):1161 －1169.

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［4］刘金祥，任继周，胡自治等.高山草原绵羊放牧生态及消化代谢系列研究V放牧绵羊采食量和消化代谢限制性因素的灰色关联度分析［J］.草业学报，2001.10(1):71－ 77.

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［8］陈耀星主编.畜禽解剖学［M］.北京:中国农业大学出版社，2001.80 －81.

［9］赖俊浩，王俊义，张同样，等.表皮生长因子对TPN大鼠黏膜机械屏障的响［J］.肠外与肠内营养，1997.4(4):213－215.

［10］李淑兰，孙庆玲.小鼠胃肠道嗜银细胞的分布及形态学观察.生物技术，7(4)，27 －29.1997.