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抗菌肽对蜜蜂细菌性病原的抑菌作用研究

2013-11-28沈克飞翟少欽张邑帆

中国蜂业 2013年3期
关键词:尿囊中蜂条带

沈克飞 翟少欽 曹 兰 杨 柳 张邑帆

(重庆市畜牧科学院,荣昌 402460)

囊状幼虫病是中蜂的重要疾病,造成严重且典型的临床症状,威胁幼虫发育和蜂群群势,甚至导致蜂群飞逃。中蜂囊状幼虫病最早于1972年发生于广东省,随后迅速蔓延到全国和东南亚的中蜂饲养国家和地区。在1972年至1976年的该病流行期间,中国境内饲养中蜂损失超过百万群。后来疾病的损耗降低,但蜂群的发病率仍在50%~70%。

引发蜜蜂囊状幼虫病(Sacbrood)的病原是蜜蜂囊状幼虫病病毒(Sacbrood virus,SBV),感染中蜂的SBV常被称为中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)。SBV为正链单股RNA病毒,属于昆虫小RNA样病毒(Picorna-like virus),被划入传染性软化病病毒属(Ifl avirus)。该病毒基因组除去Poly A尾大约含有8830个碱基,只有1个大的开放阅读框架(Open Reading Frame),编码大约2860个氨基酸残基的多聚蛋白(Polyprotein)。在病毒自身编码的蛋白酶的作用下,多聚蛋白氨基端剪切、加工产生成熟的结构蛋白,羧基端剪切、加工产生为非结构蛋白。目前,对蜜蜂病毒性病原的研究主要集中在病原检测及系统进化分析,很少涉入病毒的分离培养。病毒的鸡胚培养法是应用于病毒病的诊断、预防和防治方面的有效手段,也是研究病毒生物学特性的途径之一。本实验开展了CSBV鸡胚培养方法的尝试,以期提供简便的CSBV体外培养方法。

1 材料与方法

1.1 样本

采自重庆地区暴发囊状幼虫病的中蜂场,具有典型囊状幼虫病特征,经RT-PCR法鉴定为SBV阳性[1],于-80 ℃保存。

1.2 主要试剂

rTaq DNA聚合酶、pMD18-T载体、Trizol和PrimeScript RT-PCR Kit均购自TaKaRa公司;凝胶回收试剂盒购自OMEGA 公司。CSBV部分结构蛋白抗血清由重庆市畜牧科学院兽医研究所制备并保存[2]。

1.3 病毒分离

病死中蜂幼虫及其渗出液与生理盐水按1:10比例加入,于研磨器中研磨5 min,5 000 r/min离心10 min,收集上清,加入终浓度1000 单位双抗,37 ℃孵育30 min后,经尿囊腔接种活力旺盛的9日龄鸡胚5枚,0.2 mL/枚,37 ℃培养。同时设正常鸡胚对照。无菌收集尿囊液,并盲传5代。

1.4 分子病毒学鉴定

1.4.1 引物设计

根据CSBV广州株基因组序列(GenBank登录号:AF469603)设计扩增CSBV-CQ编码序列的引物。引物由生工生物工(上海)有限公司合成。引物序列见表1。

1.4.2 总RNA的提取

表1 用于CSBV RT-PCR扩增的引物

取3 00 μL尿囊液加入7 00 μL Trizol混匀,室温静置15 min后,加入250 μl氯仿,充分振荡后室温静置15 min;加入250 μl氯仿充分振荡后静置15 min;4℃,12 000 r/mim离心15 min;取上清,加入等体积的异丙醇,混匀后于-20 ℃静置1 h;4℃,12 000 r/min离心10 min。沉淀用70%的乙醇洗涤一次,吸干上清,沉淀溶解于100 μl经DEPC处理的去离子水中,以备反转录。

1.4.3 RT-PCR法病毒检测

使用PrimeScript RT-PCR Kit及其Random 6mers,以提取的尿囊液总RNA为模板反转录合成cDNA第一条链,实验操作按试剂盒说明书进行。以反转录合成的cDNA为模板PCR扩增CSBV-CQ编码序列。PCR反应体系为:10×PCR Buffer(含15 mM Mg2+)2.5 μl,2.5 mM dNTPs 0.5 μl,5 U/μl rTaq 0.1 μl,10 μM的上、下游引物各0.5 μl,cDNA 0.5 μl,补去离子水至25 μl。反应条件为:94℃预变性2 min;94 ℃变性30 s,45℃退火30 s,72℃延伸60 s,共30个循环;72 ℃再延伸5 min。所用引物见表1。

1.4.4 条带与序列分析

PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收目的条带,将其克隆至pMD18-T载体,用质粒上的通用引物M13+/ M13-进行双向序列测定,将所得序列在NCBI上作BLAST搜索以进行同源性分析。

1.5 免疫印迹分析

CSBV感染致死幼虫样本和接种CSBV尿囊液分别经10% SDS-PAGE分离后转印NC膜,用5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h;TBST洗涤3次;加入CSBV抗血清(1:1000稀释),室温孵育1 h;TBST洗涤3次;再加入碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG(1:5 000稀释),室温孵育1 h;TBST洗涤3次;置BCTP/NBT显色液中显色。

2 结果

2.1 鸡胚接种

CSBV第一次接种9日龄鸡胚尿囊腔后,在前4天孵化期间鸡胚未死亡,发育速度正常,胚体无明显出血点,肝脏有出血点。正常对照胚体及肝脏无出血点。连续盲传5代,鸡胚无死亡,现象同第一次接种。

2.2 病毒RT-PCR鉴定结果

RT-PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析,可见使用CSBV特异的引物从接种鸡胚尿囊液提取的总RNA中扩增出清晰、特异、大小与预期相符的条带(图1),而未接种鸡胚未扩增出条带。5次盲传尿囊液均扩增出相同条带图谱。经序列测定及序列分析得出,所扩增片段是SBV基因片段,片段拼接后获得一条长度约占SBV基因组90%的片段,与CSBV-CQ分离株(GenBank登录号:KC285046)同源性(高于99.5%)高于其他分离株。

图1 RT-PCR扩增结果 M:DNA marker DL2000;1-9:分别为引物SB1F/SB1R-SB9F/SB9R的产物

2.3 免疫印迹分析

CSBV抗血清与CSBV 感染致死幼虫样本和CSBV接种鸡胚尿囊液强烈反应而产生一条特异条带,但接种鸡胚尿囊液CSBV滴度不及感染致死幼虫样本CSBV滴度,接种鸡胚尿囊液稀释2倍后特异条带亮度极弱;未接种鸡胚尿囊液无任何条带出现(图2)。

3 讨论

图2 免疫印迹结果

囊状幼虫病正困扰着中蜂产业的发展,其危害日益受重视。病原分离培养是进行病原学研究的基础。赖德真等于1982年报道了用鸡胚组织培养囊状幼虫病病毒[3]。本实验将囊状幼虫病致死的中蜂幼虫悬液接种9日龄鸡胚,盲传5代均可见鸡胚肝脏有出血点,用RT-PCR法从接种尿囊液中扩增出了CSBV的基因组片段,运用免疫印迹法检测到接种鸡胚尿囊液存在CSBV颗粒,表明CSBV在鸡胚尿囊腔中可增殖。但接种鸡胚尿囊液免疫印迹条带亮度不及病死幼虫样本条带亮度,显示尿囊液中的病毒滴度较低。目前,SBV的体外培养主要依靠不能传代的蜜蜂中肠细胞[4],该细胞的培养需要极高的专业技能,而本实验为CSBV提供了简便的培养法,为进一步开展CSBV病原学和分子遗传学研究奠定了物质基础。

在自然感染中,SBV容易发生遗传变异,导致病毒的致病性、细胞嗜性、生物学特性等发生较大改变。依据系统进化分析可将感染西方蜜蜂和东方蜜蜂的SBV总体上分为欧洲基因型和亚洲基因型病毒,亚洲的西方蜜蜂蜂群中存在2个基因型病毒,而东方蜜蜂体中存在2个基因型基因片段[5-10]。研究指出,SBV具有型特异的遗传变异特性[10],也同其它小RNA病毒一样基因型间存在基因重组,这给适应新的蜜蜂种类提供遗传学基础和条件。

[1]曹兰,张邑帆,戴荣国,等.用RT-PCR方法鉴定中蜂囊状幼虫病病毒.中国蜂业,2011,62(7-9):33-35

[2]沈克飞,张邑帆,曹兰,等.中蜂囊状幼虫病病毒结构蛋白的表达及其抗血清的制备.中国生物制品学杂志,2013,26(1):89-92.

[3]赖德真,史伯伦,李桂仙.中蜂囊状幼虫病病毒组织培养的研究.中国养蜂,1982,2:23-24

[4]张国只.中华蜜蜂中肠细胞培养及CSBV感染中华蜜蜂和意大利蜜蜂幼虫的蛋白质组分析[D].中山大学,广东,2009.

[5]Kojima Y,Toki T,Morimoto T,et al.Infestation of Japanese native honey bees by tracheal mite and virus from non-native European honey bees in Japan[J].Microb Ecol.2011,62(4):895-906.

[6]Choe SE,Nguyen TT,Hyun BH,et al.Genetic and phylogenetic analysis of South Korean sacbrood virus isolates from infected honey bees(Apis cerana)[J].Vet Microbiol.2011,[Epub ahead of print][7 Choe SE,Nguyen LT,Noh JH,et al.Analysis of the complete genome sequence of two Korean sacbrood viruses in the Honey bee,Apis mellifera[J].Virology,2012,432(1):155-161.

[8]Grabensteiner E,Ritter W,Carter MJ,et al.Sacbrood virus of the honeybee(Apis mellifera):rapid identification and phylogenetic analysis using reverse transcription-PCR[J].Clin Diagn Lab Immunol.2001,8(1):93-104.

[9]曹兰,沈克飞,张邑帆,等.蜜蜂囊状幼虫病病毒的基因型分析[J].动物医学进展,2012,33(1):41-44.

[10]罗文华,张邑帆,沈克飞,等.重庆地区中蜂囊状幼虫病病毒型特异性遗传变异分析[J].中国生物制品学杂志,2013,26(3):315-323.

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