牛乳铁蛋白肽LfcinB（4-9）抗中蜂囊状幼虫病的作用效果研究

曹 兰 戴荣国 王瑞生 任 勤 程 尚 沈克飞 姬聪慧 罗文华

（重庆市畜牧科学院，重庆 402460）

中蜂囊状幼虫病是对中蜂养殖危害极其严重的病毒性疾病，传染性极强。该病病原为中华蜜蜂囊状幼虫病病毒，是单股正链小RNA样病毒。该病主要采取综合防治措施防控，如：换王断子、严格消毒、加强管理，使用抗病毒药物配以抗生素预防继发感染。目前，该病由于缺乏安全高效的抗病毒药物，生产中存在滥用药物现象，这使我国当前蜂产品药物残留较高，蜂产品出口受限。因而，研发高效、安全、无残留的蜂药是当今养蜂业的迫切需求。

牛乳铁蛋白肽是由牛乳铁蛋白经蛋白酶消化后释放的一系列多功能天然活性肽，其中LfcinB具有广泛的生物学活性，具有广谱杀菌、抗病毒、消炎、抑制肿瘤细胞生长及调节机体免疫反应等作用。据研究[1]，LfcinB可以抑制HIV、细胞巨化病毒、疱疹1型病毒、肝炎病毒和流感病毒等。McCann（2003）研究揭示蛋白肽可能通过作用于易感细胞表面干扰病毒与细胞表面受体的相互作用，阻止病毒吸附和进入细胞，如LfcinB和人乳铁蛋白肽LfcinH的抗疱疹病毒感染就是通过直接与宿主细胞表面的硫化肝素或粘多糖结合，阻止HSV病毒与细胞表面HS和粘多糖结合，达到抑制HSV感染的目的。本试验主要是观察LfcinB（4-9）抗中蜂囊状幼虫病的作用效果。

1 材料与方法

1.1 蜂群

要求蜂群健康无病，各蜂群的群势基本一致，平均为4足框，配置基本饲养蜂具。

1.2 LfcinB（4-9）

由L型氨基酸组成，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成制备，高效液相色谱纯度大于99%。

1.3 中蜂囊状幼虫病病毒

采集具有典型中蜂囊状幼虫病症状的染病病虫，用RT-PCR检测中蜂囊状幼虫病病毒显阳性[2]。

1.4 幼虫死亡率检测耗材

30×50cm透明薄膜、记号笔、照相机等。

试验分成5组，每个试验组3群蜂，共计15群。

1.5 病毒制备

将1 g感染中蜂囊状幼虫病的蜂幼虫放在研磨器中研磨10 min，混悬液经12 000 r/m离心10 min，吸取上清。上清经0.22μm微孔滤膜过滤，加入1000 ml糖水中，即为病毒种子液。

1.6 病毒接种

将病毒种子液在傍晚时分喷洒于试验蜂群中，每脾双面喷，最后喷巢门，连续喷洒病毒液3天，待检查发病后用于实验。

1.7 分组与给药

将蜂群分为5组，见表1。以上试验组傍晚饲喂糖浆（白砂糖：水=1：1.2），每次每足脾饲喂50 ml糖浆，隔日饲喂一次，连续9天。每9天测定幼虫死亡率。

表1 试验分组

1.8 幼虫死亡率测定方法

开箱后先将子脾蜜蜂抖落在蜂箱中，用蜂扫扫掉残留在脾上的蜂，然后将脾平放在瓷盘中，用30×50cm的薄膜贴在脾上做好定位标记，在薄膜上标记未封盖的100只幼虫或卵巢房，计数为标记幼虫或卵A只。9天后用标记的薄膜贴在原来的仔脾上，对准位置，查看红色标记的巢房是否封盖，若未封盖，在薄膜上标记并计算未封盖或者穿孔的封盖子数，计数为未封盖幼虫或卵B只。未封盖的幼虫或穿孔封盖子一旦发病，必将死亡即假定认为该幼虫发病死亡，该群幼虫的发病率即为该群的幼虫死亡率。同时，做好下一次的幼虫或卵标记，重复上述试验。

幼虫死亡率=B/A×100%[3]

1.9 病情指数计算方法[3]

按幼虫发病死亡轻重程度分级。0级：子脾上未发现病虫；1级：病死虫数占总幼虫数小于5%；2级：病死虫数占总幼虫数的5%～30%；3级：病死虫数占总幼虫数大于30%。病情指数越大，说明病害越严重。

1.1 0 防治效果[3]

利用各处理组蜂群的幼虫死亡率，计算LfcinB（4-9）对蜂群的防治效果。

2 结果

2.1 LfcinB（4-9）对中蜂囊状幼虫病幼虫死亡率的影响

试验蜂群攻毒后，测定蜂群用肽前、用肽后第9天和第18天的幼虫死亡率，见表2。给药后第9天和第18天，相对于攻毒未给药的第4组，第1、第2、第3给药组幼虫死亡率明显降低。给药后第9天，第2组和第3组较第4组差异显著，幼虫死亡率分别降到18.67%和19.00%，第四组幼虫死亡率升高为46.50%；给药后第18天，第1组和第2组较第4组差异显著，幼虫死亡率分别为23.46%和19.63%，第3组与第4组差异极显著，幼虫死亡率为17.08%，第4组幼虫死亡率37.25%。

表2 牛乳铁蛋白肽对中蜂囊状幼虫病幼虫死亡率的影响

2.2 LfcinB（4-9）对蜂群病情指数的影响

试验开始前后跟踪测定每群幼虫死亡率多次，即给肽前（第一次、第二次）、给肽后（第三次、第四次）和停肽后（第五次、第六次）。饲喂LfcinB（4-9）17天以后，中蜂囊状幼虫病幼虫死亡率的病情指数呈下降趋势，第3组的病情指数较其它两组的低。三组病情指数均在66.7%以上，低于发病没用肽的第4组，高于没发病没用肽的第5组。

图1 LfcinB（4-9）对试验蜂群病情指数情况图

2.3 LfcinB（4-9）对中蜂囊状幼虫病的防治效果

LfcinB（4-9）对中蜂囊状幼虫病在短期（9天）内防治作用不明显，最高防治效果为第2组59.85%，最低防治效果为第一组50.54%，第三组为59.14%。长时间（18天后），LfcinB（4-9）对中蜂囊状幼虫病防治作用较突出，其中第三组的防治效果最好为72.02%，最低为第一组40.32%，第二组为55.14%。此结果表明低浓度（第三组）的LfcinB（4-9）对中蜂囊状幼虫病的防治效果较好。

3 讨论

由本次试验可以看出，饲喂LfcinB（4-9）后，受试蜂群病情有所好转，低浓度2.83mg/1000ml的Lf cin B（4-9）的糖浆治疗效果较高浓度的LfcinB（4-9）较好。至于2.83mg/1000ml的LfcinB（4-9）糖浆是不是最佳防治该病的浓度，还需进一步研究。另外，在短时间（9天左右）情况下LfcinB（4-9）对中蜂囊状幼虫的防治效果不明显，最高为59.85%，长时间内（18天左右），LfcinB（4-9）对中蜂囊状幼虫病的防治效果最高为72.02%，对蜂群病毒病来说有轻微治疗效果。在第二年繁蜂季节，笔者发现凡饲喂了LfcinB（4-9）的蜂群均未发幼虫病，而未饲喂LfcinB（4-9）的阳性对照组仍可见严重的中蜂囊状幼虫病。笔者认为蜂群感染病毒发病后，在幼虫期任何一种药物可能都无法挽回感染蜂群单个个体的幼虫生命，因为正常的幼虫历经5天后即成封盖子蜂蛹，处于幼虫期的5天时间，要想使用药物阻断病毒繁殖感染其它幼虫或者杀灭幼虫体内病毒，是非常困难的。本试验对发病蜂群施肽的目的在于防止新孵出的健康幼虫被带毒病死虫感染，所以使用LfcinB（4-9）防治中蜂囊状幼虫病需要过程和时间，其效果更多在于蜂群施肽后期的抗病力表现。

表3 LfcinB（4-9）对中蜂囊状幼虫病的防治效果

对于LfcinB（4-9）对中蜂囊状幼虫病的防治作用，笔者设想其作用机理。在发病蜂群内，病死幼虫感染新孵出的健康幼虫，主要传播者是成年蜂，因为成年蜂体内也带毒，使用牛乳铁蛋白肽饲喂蜂群，首先是成年蜂消化道接触牛乳铁蛋白肽，笔者设想该肽可以修复或润滑通畅成年蜂体内消化道，使其病毒不易在体内生存，从而减少新孵出幼虫的感染机会。

[1]陈历俊，姜铁民.乳铁蛋白生物功能及基因表达[M].北京：科学出版社，2007.

[2]曹兰，张邑帆，戴荣国，等.用RT-PCR方法鉴定中蜂囊状幼虫病病毒.中国蜂业，2011，62（7-9）：33-35.

[3]王建鼎，梁勤，苏荣.蜜蜂保护学[M].中国农业出版社，1997.