基于NRG－1及其受体ErbB4探讨醒脑开窍针法在缺血性中风中的作用*

张丽丽，刘宝山，褚 芹△

(1.天津中医药大学，天津300193;2.天津中医药大学第一附属医院，天津300193)

中风病按病理变化可分为出血性中风和缺血性中风，其中缺血性中风占60～80%以上。缺血性中风的防治一直是国内外医学界研究的重点与难点。临床研究显示，醒脑开窍针法对中风有确切的疗效[1－4]，经30余年的临床实践和多学科的基础研究，已成为一套科学的、规范的中风病诊疗体系。

神经调节蛋白－1(Neuregulin－1，NRG－1)是一种神经营养因子，能够抑制脑缺血诱导的神经元凋亡，在缺血性卒中过程中具有神经保护作用。NRG－1的功能性受体是由ErbB受体酪氨酸激酶所组成，其中ErbB4既能与NRG－1结合，又具有很强的酪氨酸激酶活性。国内外研究[5－7]显示外源性神经营养因子NRG－1可减轻缺血再灌注导致的神经元损伤，作为抵抗缺血性卒中的内源性神经保护因子，为脑缺血损伤的临床治疗提供了一个新思路。但外源性神经营养因子难以通过血脑屏障，如何诱导内源性神经营养因子的表达成为亟待解决的问题。本研究以NRG及其受体为切入点，通过醒脑开窍针法电针刺激水沟和内关，应用HE、TUNEL和免疫组化技术，观察醒脑开窍针法对缺血/再灌注大鼠脑组织病理形态、神经元凋亡、NRG－1及其受体ErbB4蛋白表达的影响，探索醒脑开窍针法在缺血性中风中的神经保护作用是否与诱导内源性神经营养因子NRG－1及其受体ErbB4的表达有关，为醒脑开窍法治疗缺血性中风提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备及分组

健康雄性SD大鼠，体重200～250 g。采用 Zea Longa[8]改良的线栓法制备动物脑缺血再灌注模型，缺血1 h后拔出线栓实现再灌注，再灌注时间为24 h。

神经功能评定采用Zea Longa[8]神经功能评分标准。0分:没有神经功能缺陷;1分:提起尾巴右侧前腿不能伸直;2分:行走时向右侧偏斜;3分:行走时向右侧倾倒;4分:意识不清或无自主性运动。对MCAO大鼠进行神经功能评估，1≤评分≤3分者纳入实验。

将造模成功的18只SD大鼠按体重分为3个组，再将每组大鼠随机分为模型组、穴位组(醒脑开窍组)和非穴位组，每组6只;另设正常组和假手术组，每组各6只。

1.2 实验主要仪器和试剂

SP－9000免疫组化染色试剂盒(北京中杉公司)、DAB酶底物显色试剂盒(北京中杉公司)、BCA蛋白定量试剂盒(Pierce公司)、Western Blotting Luminol Reagent(Santa Cruz公司)、Tunel检测试剂盒(Roche公司)、琼脂糖(西班牙Agarose公司)、显微镜(日本奥林巴斯，BX51T－PHD－J11)、CMOS(日本奥林巴斯)、多功能真彩色细胞图象分析管理系统(美国Media Cybernetics公司Image－Pro Plus)和HANS LHZOZS电针仪。

1.3 实验动物干预

穴位组和非穴位组大鼠使用HANS LH202S电针仪，疏密波，电压2 V，频率2/15 Hz，电流1 mA。穴位组电针仪的两极接水沟、内关(同侧)，水沟定位为大鼠唇裂鼻尖下1 mm正中处，用30号0.5寸华佗牌毫针向鼻中隔方向斜刺0.2～0.3 cm;内关为大鼠前肢内侧，距腕关节约3 mm的尺桡骨缝间，用30号0.5寸华佗牌毫针直刺0.2～0.3 cm。非穴位组的电极一端接同侧腋横纹下3 mm的非穴位处，另一端接尾骨尖下3 mm的非穴位处。在穴位组和非穴位组，大鼠再灌注后1 h、12 h及24 h各施用电针1次。其余各组不予任何处理。

1.4 切片制备

大鼠于再灌注24 h时常规灌注取材。将大鼠深度麻醉，经心脏灌注，迅速断头取脑，以视交叉为中心取5 mm的冠状切片，置于4%多聚甲醛中固定24 h。梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。用切片机行连续冠状切片，厚5 um，隔五取一，行HE、TUNEL和免疫组化染色。

1.5 HE 染色步骤

将石蜡切片放于60℃烤箱中烘烤30 min，取出后至室温;二甲苯透明脱蜡各10 min;酒精梯度脱水各10 min;苏木素染色15 min，清水冲洗10 min;酒精分色3 min，清水冲洗10 min;伊红染料复染3～5 min;梯度酒精脱水各10 min;二甲苯透明，中性树胶封片;光镜下观察脑组织染色情况。

1.6 TUNEL 法

心脏灌注后，取脑，从视交叉开始，取3 mm厚冠状切片，制作石蜡切片(5 um)，行TUNEL染色。染色步骤按照TUNEL试剂盒说明书进行操作。细胞核呈棕色颗粒者为阳性细胞，结合形态特征，可确立凋亡细胞。

1.7 免疫组化具体步骤

将石蜡包块切成厚度为5 μm连续组织切片，贴于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上，60℃烘烤1 h。将切片先后用二甲苯脱蜡、乙醇常规至水化。切片放入盛有柠檬酸盐的缓冲液中，再放入微波炉内用中高档进行抗原修复8 min，自然冷却至室温。1%甲醇双氧水，室温10 min，消除内源性过氧化酶活性，PBS洗3次，每次5 min。滴加10%山羊血清封闭液，室温20 min，勿洗。滴加一抗，4℃过夜，PBS洗3次，每次5 min。滴加生物素化二抗(IgG)，37℃孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min。切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S－A/HRP)，37℃20 min，PBS洗 3次，每次5 min。DAB显色:使用DAB显色试剂盒1 ml蒸馏水加显色剂A、B、C各1滴，混匀，滴加至切片上，光学显微镜下观察，以棕黄色为阳性表达，显色约10 min，自来水冲洗终止显色。苏木素复染1 min，自来水返蓝。经梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。显微镜观察，进行400×的显微照相。

1.8 图像分析

每只大鼠切片中选取呈典型反应的3张切片，每张切片在高倍镜下(400×)对皮层阳性细胞高表达区域，随机选取5个视野进行计数。采用IPP软件分析系统(Image－Pro Plus 6.0)对染色结果进行分析处理。测量累积光密度(integrated optical density，IOD)和面积(area)，计算平均光密度(average optical density，AOD)IOD/area。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 HE 染色

HE染色可见缺血再灌注模型皮层缺血梗死区广泛的神经细胞变性坏死，胞体变形，深染，见封三彩图1中D。然而，在缺血半暗带神经细胞肿胀，体积增大，形态变圆，细胞间隙变小，见封3彩图1中C。缺血侧大脑皮层可见梗死区(封三彩图1中*处)大量神经细胞变形深染，而周围区域(封三图1中△处)神经细胞体积增大，只有极少量变性坏死的神经细胞。

2.2 TUNEL 结果

正常组和假手术组的大鼠在大脑皮层几乎未发现凋亡细胞。模型组、非穴位组和穴位组出现大量的凋亡细胞，凋亡细胞的百分率分别为(36.78±5.43)%、(31.83 ±5.74)%和(27.2 ±8.31)%，但穴位组与模型组、穴位组与非穴位组比较，差异均无统计学意义(P ＞0.05)。

2.3 免疫组化结果

正常组和假手术组大鼠大脑皮层仅有少量NRG－1及ErbB4的阳性细胞表达。缺血1 h再灌注24 h，模型组、非穴位组大鼠大脑皮层缺血半暗带NRG－1阳性细胞表达增加，而穴位组NRG－1阳性细胞表达进一步增加，与其他组比较差异有统计学意义(穴位组与正常组比较P=0.000，穴位组与假手术组比较P=0.000，穴位组与模型组比较 P=0.018，穴位组与非穴位组比较P=0.022)。穴位组ErbB4阳性细胞表达，与正常组和假手术组比较，有统计学意义(穴位组与正常组比较P=0.028，穴位组与假手术组比较P=0.010);而与模型组或非穴位组之间差别无明显统计学意义(P＞0.05)。见封三彩图2和表2。

表2 NRG－1及ErbB4免疫组化染色结果的IPP图像分析(±s)

表2 NRG－1及ErbB4免疫组化染色结果的IPP图像分析(±s)

注:与正常组比较，▲P ＜0.05;与假手术组比较，△P ＜0.05;与模型组比较，*P ＜0.05;与非穴位组比较，★P ＜0.05。

6 0.0636 ±0.0170 0.0672 ±0.0138假手术组 6 0.0741 ±0.0064 0.0598 ±0.0045模型组 6 0.0930±0.0081▲△ 0.0772±0.0087△非穴位组 6 0.0936±0.0132▲△ 0.0797±0.0198穴位组 6 0.1079 ±0.0098▲△＊★ 0.1056 ±0.0195平均光密度正常组组别 样本数 NRG－1平均光密度 ErbB4▲△

3 讨论

在本研究中，模型组大鼠皮质缺血半暗带NRG－1阳性细胞表达高于正常对照组和假手术组，提示内源性神经营养因子增多，其原因可能是梗死本身作为一种刺激因素促进了内源性NRG－1的表达，这在Parker等[9]和 Pankonin 等[10]的研究中已经证实。穴位组NRG－1的表达高于模型组和非穴位组，提示电针刺激水沟和内关使皮层缺血半暗带内源性NRG－1的表达增加更显著。Xu和Ford[11]利用大鼠大脑中动脉闭塞模型对缺血性卒中后ErbB受体的分布进行了研究，与NRG－1相似，在MCAO后24 h同侧皮质梗死周围可观察到ErbB4的大量表达。电针刺激水沟和内关能提高缺血再灌注大鼠内源性NRG－1的表达，弥补了外源性NRG－1半衰期短、不能进入血脑屏障的缺陷。本研究结果表明醒脑开窍针刺法在缺血性中风的神经保护作用与提升内源性NRG－1及其受体ErbB4有关，为醒脑开窍法治疗缺血性中风提供了实验依据。

凋亡在脑缺血的发展中起着重要作用。在脑缺血性损伤发生发展过程中，凋亡神经元的多少直接决定着坏死的神经元数量和梗死区域的面积，与缺血损伤后继发性损害的程度密切相关，所以及时遏制凋亡的启动环节是挽救凋亡前期神经元的关键。醒脑开窍针法与非穴位和模型组比较，在降低凋亡细胞百分率上虽未显示统计学差异，但是在一定程度上抑制了神经元的凋亡。神经保护作用可能通过如下作用:针刺水沟可直接兴奋上行激活系统，解除脑细胞的抑制状态，可特异性地增加颈动脉血流，纠正血流动力学紊乱，改善脑循环;针刺内关可改善中风患者的心排血量，改善脑血氧供应。从而改善缺血半暗带血氧供应，减少神经元凋亡。

目前，针刺诱导内源性NRG－1和ErbB4表达的研究国内外未见报道。本研究采用在体实验，对醒脑开窍针刺法治疗缺血性中风的机理从诱导内源性的神经调节蛋白NRG－1角度进行研究。研究结果证明醒脑开窍针刺法在缺血性中风的神经保护作用与提升内源性NRG－1及其受体ErbB4有关。

[1]石学敏.“醒脑开窍”针刺法治疗中风病9005例临床研究[J].中医药导报，2005，11(1):3 －5

[2]庞国军，王可博.醒脑开窍针刺法治疗中风恢复期疗效观察[J].针灸临床杂志，2007，23(5):9 －20

[3]刘华公，王虹.醒脑开窍针刺法治疗中风后遗症126例临床报道[J].中医外治杂志，2002，11(4):12

[4]杨志新，石学敏.醒脑开窍针刺法治疗中风疗效与安全性的系统评价[J].中国针灸，2007，27(8):601 －608

[5]Xu Z，Jiang J，Ford G，et al.Neuregulin － 1 is neuroprotective and attenuates inflammatory responses induced by ischemic stroke[J].Biochem Biophys Res Commun，2004，322:440 －446

[6]Guo WP，Wang J，Li RX，et al.Neuroprotective effects of neuregulin －1 in rat models of focal cerebral ischemia[J].Brain Research，2006，1087:180－185

[7]Shyu WC，Lin SZ，Chiang MF，et al.Neuregulin － 1 reduces ischemia－ induced brain damage in rats[J].Neurobiology of Aging，2004，25:935－944

[8]Zea Longa E，Weinstein Arison.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20:84

[9]Parker MW，Chen Y，Hallenbeck JW，et al.Neuregulin expression after focal stroke in the rat[J].Neurosci Lett，2002，334(3):169 － 172

[10]Pankonin MS，Sohi J，Kamholz J，et al.Differetial distribution of neuregulation in human brain and spinal fluid[J].Brain Research，2009，1258:1 －11

[11]Xu ZH，Ford BD.Upregulation of erbB receptors in rat brain after middle cerebral arterial occlusion[J].Neurosci Lett，2005，375(3):181－186