头穴丛刺对抑郁模型大鼠下丘脑CRF表达的影响*

郑祖艳，徐博佳，周丽颖，吴明娟

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040;2.黑龙江中医研究院，黑龙江哈尔滨150001)

抑郁症目前已成为全球性的主要精神卫生问题，世界卫生组织预计，到2020年抑郁症造成的疾病负担将列为全球疾病总负担第2位，仅次于冠心病，因而被称为新世纪健康的第二杀手[1]，其病因尚未完全阐明，但生活事件(life events，LEs)，尤其是应激性生活事件起“扳机”作用[2]。抑郁症发病前约92%的患者有LEs，提示LEs在抑郁症发生中起重要作用[3]。在神经内分泌改变上体现为下丘脑－垂体－肾上腺(hypothalamus pituitary ad －renal，HPA)轴的功能亢进，在应激引起的一系列病理生理和行为反应中，促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)起着重要作用，因此笔者选择目前国外学者广泛采用的慢性轻度不可预见性应激刺激结合孤养法相结合建立抑郁动物模型展开研究[4－5]，观察针刺对下丘脑 CRF 表达的影响，深入探讨针刺治疗抑郁症的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物

64只3月龄清洁级健康Wister雄性大鼠，体重180～220 g，购于黑龙江中医药大学动物实验中心。

1.2 实验分组

将动物在实验室适应性饲养1周，自由进食水。然后对每只大鼠进行开野实验，剔除水平运动加垂直运动次数平均大于100次或少于50次的大鼠，再将64只大鼠随机分为正常对照组、模型组、盐酸氟西汀组和头穴丛刺组各16只，正常对照组4只/笼，其余组单笼饲养，末次治疗后再将正常对照组、模型组、盐酸氟西汀组和头穴丛刺组各随机再分为两组，每组8只大鼠，分别进行大鼠下丘脑CRF阳性细胞表达试验及下丘脑CRFmRNA相对含量表达试验。

1.3 实验器材

－70℃冰箱;恒温高速离心机;促肾上腺皮质激素释放因子放免试剂盒;自制敞箱(长80 cm、宽80 cm、高40 cm);华佗针灸针;电针治疗仪。

1.4 模型制备

按照文献方法[6]制备大鼠慢性应激抑郁模型。模型组、头穴丛刺组、盐酸氟西汀组单笼饲养并接受14天各种不同的应激刺激，使动物不能预料刺激的发生。刺激包括冰水游泳、热应激、禁水、禁食、夹尾、电击足底、摇晃、昼夜颠倒等刺激，每天随机安排1种，在刺激之前给予持续10 s的铃声提示，正常对照组每日抓取1次，予以10 s铃声提示但不予刺激。

1.5 治疗方法

经14天慢性应激刺激后，盐酸氟西汀组给予盐酸氟西汀1 mg/kg每日1次，连续给药14天;头穴丛刺组参照《实验动物穴位图谱》选“百会”、“神庭”及“四神聪”，用华佗牌30号半寸毫针进行针刺，向后平刺0.2 cm左右，“百会”、“神庭”针柄接电针治疗仪，频率2 Hz，电流强度0.6 mA左右，以大鼠头部微颤为宜。留针20 min，每日1次，连续针刺14天。

1.6 取材及标本制备

对各组大鼠进行开野实验后:①随机每组取8只，将大鼠麻醉后，仰卧固定于手术台，开胸暴露心脏，左心室插管高压灌注生理盐水，同时剪开右心耳，待肝脏变白后再用4%多聚甲醛灌注固定，断头取脑，浸于4%多聚甲醛固定24 h，分离下丘脑，将下丘脑石蜡包埋、切片，免疫组化法检测各组大鼠下丘脑CRF阳性细胞的表达。②每组取另外8只，将大鼠麻醉后立即断头取脑，迅速分离下丘脑置匀浆器，冰浴加Trizol充分混匀后加入氯仿低温高速离心取上清液，加入异丙醇，再次低温高速离心，弃上清液，留取白色沉淀，经乙醇洗涤烘干，加DEPC水溶解、55℃促溶10 min后，置－70℃冰箱内贮存备用，RT－PCR法检测下丘脑CRFmRNA表达。

1.7 统计方法

运用统计软件SPSS16分析实验数据，数据以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 开野实验结果

见表1。造模前各组大鼠的水平及垂直运动次数无显著差异(P＞0.05)。治疗前与正常组相比，模型组、头穴丛刺组、盐酸氟西汀组大鼠的水平及垂直运动次数明显降低，有显著性差异(P＜0.05);治疗后，头穴丛刺组、盐酸氟西汀组的水平及垂直运动次数与模型组相比明显增加，有显著性差异(P＜0.05)。通过观察模型组大鼠水平及垂直运动次数逐渐减少说明随刺激的时间延长，大鼠的抑郁程度也在逐步加重，提示头穴丛刺疗法能增加抑郁模型大鼠的运动度及好奇度，具有防治抑郁的作用。

表1 Open－filed法测定各组大鼠水平及垂直运动情况(±s，次)

表1 Open－filed法测定各组大鼠水平及垂直运动情况(±s，次)

注:与正常组比较，*P ＜0.05;与模型组比较，▲P ＜0.05;与头穴丛刺组比较，△P＞0.05。

16 81.1 ±15.7 77.3 ±14.7 72.1 ±15.9模型组 16 79.3 ±16.3 42.3 ±12.8* 29.9 ±11.2头穴丛刺组 16 79.6 ±15.9 44.6 ±14.5* 61.4 ±19.9▲盐酸氟西汀组 16 82.7 ±14.8 41.0 ±15.6* 68.2 ±14.3造模前 治疗前 治疗后正常组组别 n▲△

2.2 下丘脑CRF的表达

见表2。模型组与正常组比较，大鼠下丘脑CRF阳性细胞比及下丘脑CRFmRNA相对含量表达模型组明显高于正常组(P＜0.05)，头穴丛刺治疗可明显降低抑郁模型大鼠下丘脑内的CRF表达(P＜0.05)，疗效与盐酸氟西汀组类似(P＞0.05)。

表2 各组大鼠下丘脑CRF阳性细胞比及下丘脑CRFmRNA相对含量表达

3 讨论

抑郁症的病因至今尚未彻底阐明，目前认为，长期慢性、低水平的应激源是促进抑郁发生、发展的主要原因。慢性不可预知性大鼠应激模型就是根据此理论建立的，这一模型已成为国内外学者探讨抑郁症发病机制和抗抑郁药作用机制而广泛应用的动物模型。前期实验证明头穴丛刺法可以明显改善慢性抑郁模型大鼠的行为学改变[6]，与本实验结果一致，并且与阳性对照组盐酸氟西汀组比较，开野实验未见明显差别，提示头穴丛刺在提高模型大鼠活动度与求知度方面可达到与西药盐酸氟西汀类似效果。

应激是机体对外界伤害性环境变化的反应，短时间应激反应可使机体渡过难关、危险以适应环境变化，但长时间过度应激刺激会造成机体功能紊乱，出现对周围事物的兴趣降低、食欲减退、生存欲望低、学习记忆能力下降等症状，CRF作为一种应激激素和脑发育中关键的神经调节物质，主要刺激垂体前叶释放促肾上腺皮质激素。当机体长期处于应激状态时，HPA轴功能持续亢进，CRF释放增加，肾上腺皮质激素分泌增加，机体可出现抑郁症状[7]。CRF神经元主要位于下丘脑，本研究发现慢性应激模型大鼠下丘脑内CRF阳性细胞比及下丘脑CRFmRNA相对含量表达均较正常对照组明显升高，证明长期慢性应激刺激可造成大鼠脑内CRF表达增加同时伴随行为学改变，并且与行为学改变正向相关，头穴丛刺可以明显降低大鼠脑内CRF的表达，并纠正大鼠行为学的改变，效果接近阳性对照组盐酸氟西汀组。证明头穴丛刺抗抑郁作用可能与干预调整因长期慢性应激刺激造成的CRF增高有关，为今后针刺抗抑郁机理研究提供依据。

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