替米考星在黄羽肉鸡组织中残留消除规律研究

余军军，章 敏，陈绮娴，宁 军，韦 田，覃健萍

(广东温氏食品集团股份有限公司，广东新兴527439)

替米考星是由泰乐菌素的一种水解产物半合成的畜禽专用抗生素，该药首先由英国ELanco动物保健品公司在20世纪80年代开发成功，目前我国农业部已批准替米考星原料、预混剂、溶液剂和注射液的生产[1-2]。替米考星为广谱抗菌药，临床主要用于治疗牛[3]、山羊[4]、猪[5]、鸡等动物因敏感菌引起的疾病，尤其对呼吸道感染效果更为明显，其对胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、肺炎链球菌、化脓棒状杆菌及畜禽霉形体等具有比泰乐菌素更强的活性[6]。同时，替米考星具有肝、肾毒性，并可损害人体前庭和耳蜗神经，长期使用会引起耐药性的产生。因此，我国对鸡体内替米考星的最高残留限量做了严格规定[7]。目前国内外针对替米考星残留代谢消除规律的研究报导文献多以白羽肉鸡为实验动物，由于禽品种多样性而使抗生素休药期应用范围产生局限性。为了对其在黄羽肉鸡体内的残留消除进行了解，以便更好地使用该药防治动物疾病，同时为制定对人类安全的休药期提供可靠的依据，特进行了本次试验。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和溶液 替米考星对照品(纯度98.0%，Lot:00608，德国 Dr.Ehrenstorfer公司)。替米考星储备液(1 mg/mL)，准确称量约50 mg替米考星标准品，置50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，密封，置-20℃冰箱中保存。使用时配成不同浓度的标准工作液。甲醇、乙腈、甲酸、正己烷等均为色谱纯，德国默克公司。

1.2 仪器设备 液质联用仪，Agilent1200液相系统和QQQ6410B三重四级杆质谱串联组成;组织匀浆机，JZ-Ⅱ型，天津四方电器设备厂;氮吹仪，UGC-24M型，北京优晟联合科技有限公司;微量分析天平，BT125D，德国赛多利斯;高速离心机，5804R，德国 Eppendorf;C18 SPE 小柱，5 mL/1g，上海安谱科学仪器有限公司。

1.3 实验动物及用药 供试鸡为4种优质肉鸡(矮脚黄鸡、竹丝鸡、天露草鸡、天露黑鸡)，40日龄，体重在1.5～2 kg之间，每一品种肉鸡50只，共计200只，由集团技术中心试验肉鸡场提供，自由饮水、采食。试验前，饲喂5日不含药物的全价饲料，观察鸡只健康。连续饲喂添加200 mg/kg替米考星含量的全价饲料5 d，然后改投不含药物的饲料。同时，每一品种分出10只对照鸡，饲喂不含替米考星的全价饲料。分别在停药后6 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d 处死试验鸡，每时间点每一品种处死5只鸡，摘取肝脏、鸡肉冷冻保存备用。

1.4 饲料的配制 20%替米考星可溶性粉，批号12111001，购于西安乐道生物科技有限公司。使用前按上述剂量添加到全价饲料中并混匀，即200 g可溶性粉拌料200 kg饲料。

1.5 检测条件 液相条件:色谱柱:Agilent Zorbax Eclipse Plus C18，3.0 mm ×100 mm，1.8 μm;流动相为0.2%甲酸水溶液∶0.2%甲酸乙腈溶液(30∶70);流速0.25 mL/min;柱温35℃;进样量5 μL。

质谱条件:电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应监测(MRM)，毛细管电压4000 V，雾化器压力25 psi，雾化器流速10 L/min，离子源温度350℃。

1.6 标准曲线 取一定量的标准贮备液用30%乙腈水依次稀释成 10、50、100、200、500、1000 μg/L的系列标准浓度，制作标准曲线。

1.7 样品处理 称取(4±0.04)g已匀浆试样置于50 mL聚丙乙烯离心管中，加入10 mL乙腈，10000 r/min 漩涡30 s，300 r/min 振荡15 min，4500 r/min离心5 min，上清液移入50 mL离心管中，用10 mL乙腈重复提取残渣，合并上清液。取5 mL提取液，40℃下氮气吹至近干，加入5 mL 20%乙腈水溶液，5 mL正己烷漩涡混匀后离心。下层液体进一步用5 mL甲醇活化的C18小柱净化，用5 mL 20%乙腈水洗涤，5%的氨甲醇6 mL洗脱，收集洗脱液，40℃下吹干，残渣用1 mL 30%乙腈水溶解，过0.22 μm的微孔滤膜，上机检测。

1.8 检测限和定量限 取空白的鸡肌肉、肝脏组织，5个平行，分别按上述样品处理方法处理样品。测得基线噪音值，按3信噪比计算检测限，10倍信噪比计算定量限。

1.9 回收率和精密度 分别取空白的肌肉、肝脏组织，添加质量浓度为0.5、5、20 μg/mL的标准工作液 100 μL，制得低、中、高 3 个浓度(12.5、125、500 μg/kg)样品，按1.7项样品处理方法分别处理，分别取5 μL测定，计算回收率;每个浓度做5个平行样品，连做3 d进行精密度统计。

2 结果

2.1 线性范围 浓度为10～1000 μg/L范围内色谱峰面积与浓度呈现线性相关，其线性方程为:Y=105327X，R=0.9998。在分析样品时，按低浓度到高浓度进行，当浓度超出此范围，则稀释样品即可。

2.2 质谱条件 用适宜浓度1.0 μg/mL的标准溶液进质谱，在文献报道条件[8-9]的基础上使用安捷伦Masshunter Optimizer质谱参数自动优化软件优化质谱参数，以得到最佳的检测条件，结果见表1。

表1 替米考星的MRM离子对及质谱条件参数

2.3 检测限与定量限 按5个空白样品的基线噪音值求其平均值，按3倍信噪比S/N计算检测限、10倍信噪比S/N计算定量限，得鸡肌肉、肝脏组织中替米考星的检测限和定量限分别为0.5 μg/kg、1 μg/kg。

2.4 回收率与变异系数 替米考星在12.5、125、500 μg/kg 3个添加水平上，平均回收率为:肌肉76.35% ～94.36%，肝脏81.25% ～102.73%，变异系数范围在2.3% ～13.4%(n=5)之间。

2.5 残留消除规律 鸡各组织中替米考星平均残留量见表2。从表2可以看出，替米考星在肝脏中残留最高，肌肉中较低，此结果同李建成等[10]报道的结果类似。消除曲线见图1-图4，由图可见，替米考星预混剂在肌肉、肝脏中消除速率相似，且4个肉鸡品种体内消除规律具有相似性。在停药10 d后肌肉、肝脏中替米考星原型已基本低于最高残留限量(肌肉75 μg/kg、肝脏1000 μg/kg)。

表2 连续饲喂5 d后肉鸡肌肉、肝脏中替米考星原型平均含量(n=5)

图1 替米考星在肉鸡组织中的消除曲线

2.6 休药期 农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》[7]规定了替米考星在肉鸡肌肉、肝脏的最大残留量分别为75 μg/kg和1000 μg/kg。用休药期计算软件WT1.4计算替米考星在四个品种肉鸡的休药期分别为:竹丝鸡18 d、矮脚黄鸡17 d、天露草鸡19 d、山坑凤20 d。

3 讨论与小结

在兽药组织残留消除规律研究中，组织药物浓度检测方法的选择至关重要，并且必须于研究开始前选择和确证。基于高效液相色谱-串联质谱法的高特异性、准确性和精密度，本研究选择高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)作为组织药物浓度测定方法。本研究在参考文献[8]的基础上，经过优化，建立了组织中替米考星的高效液相色谱-串联质谱检测方法，方法简便，数据重复性好，回收率均在70%以上，批内及批间相当标准偏差均小于15%，说明该方法有良好的精密度，能够满足检测组织中替米考星残留的条件，与文献报道值[8-9]相符。

整个替米考星消除过程中，4个品种肉鸡肝脏中替米考星浓度均高于肌肉，且肝脏与肌肉组织中替米考星消除速率相似，表明肝脏可以作为主要残留器官计算休药期。同时，在停药10 d后肌肉、肝脏中替米考星原型已基本低于最高残留限量，这些结果均与李建成等[10]报道相同，说明替米考星可溶性粉在黄羽肉鸡与白羽肉鸡体内的残留消除规律具有相似性。

休药期是指食品动物从停止给药到允许动物屠宰或其产品上市的间隔时间。贾柱等[11]提到，农业部第278号公告中规定了一些药物的休药期，但其依据是国外的资料，各种药物由于剂型或处方的不同以及动物本身的差异，在体内的代谢消除情况也存在较大的差异，因此必须通过实验得出数据，并利用软件计算出恰当的休药期。WT1.4是一个根据德国和兽医产品委员会制定的统计方法来计算休药期的软件，在计算休药期过程中，确保有95%的可信限并使99%的残留数据低于MRLs，从而充分考虑了用药群体及动物品种差异。李建成等[10]以组织中药物浓度低于最高残留限量的最短停药天数作为药物在肉鸡体内的休药期，得出替米考星在肉鸡体内休药期为11 d，这种算法只利用了停药11 d后组织中平均药物浓度，并未利用肉鸡停药后替米考星残留消除规律，缺乏对肉鸡品种和个体影响休药期等方面的考虑。

常规饲养条件下，以200 mg/kg替米考星剂量水平添加到饲料中饲喂4种黄羽肉鸡，连续饲喂5 d后，休药第10天时，肉鸡肝脏和肌肉中替米考星残留量均低于 MRLs(肝脏 1000 μg/kg、肌肉75 μg/kg)。根据我国和欧盟药品管理局(EMEA)规定的替米考星药物在肉鸡组织中的MRLs标准，黄羽肉鸡按上述方法喂服替米考星后，其休药期(WDT)分别为矮脚黄鸡17 d、天露草鸡19 d、山坑凤20 d。为确保食品安全系数更高，建议替米考星在黄羽肉鸡体内的休药期为20 d。

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