超高效液相色谱-串联质谱法检测动物肌肉组织中19种β-受体激动剂残留

2013-11-23毕言锋苏富琴徐秉恩王鹤佳徐士新

中国兽药杂志 2013年11期

李丹，孙雷，毕言锋，苏富琴，徐秉恩，王鹤佳，徐士新

(中国兽医药品监察所国家兽药残留基准实验室，北京100081)

β-受体激动剂(β-agonists)是一类化学合成的苯乙醇胺类物质，在饲料中添加该类药物给动物饲喂后具有营养再分配作用，可以明显提高动物的瘦肉率，但是人们食用了这些药物残留的畜禽产品后会出现面色潮红、头痛、头晕、胸闷、心悸、四肢麻木等不良反应症状，严重的可能危及生命。因此国际上很多国家先后立法禁止在畜禽生产上使用该类药物，我国政府也明令禁止其使用。近年来，随着班布特罗、齐帕特罗等其它种类的β-受体激动剂在养殖等环节非法添加使用的出现，2010年农业部1519号公告再次禁止在饲料和动物饮水中使用氯丙那林、齐帕特罗等新型的β-受体激动剂，但农业部现行的1025号公告-18-2008仅能对动物肌肉组织中9种β-受体激动剂进行检测，给违禁使用新型β-受体激动剂的查处造成不便。本研究针对我国居民消费量比较大的猪、牛和羊肌肉组织样品，研发一种能快速准确检测其中19种β-受体激动剂残留的UPLC-MS/MS检测方法，为行政主管部门对市场上已经出现和可能出现的其他种类新型的β-受体激动剂进行有效监管提供技术支撑，满足多种β-受体激动剂同时检测的要求。

1 材料与方法

1.1 仪器 Acquity UPLC-Quattro premier XETM质谱联用仪(Waters公司);DKZ-2型电热恒温振荡水槽(上海精宏实验设备公司);Delta 320 pH计(Mettler Toledo公司);Biofuge Strators高速冷冻离心机(贺利氏公司);Organomation Associates氮吹仪(Jnc公司);SIR4漩涡混合器(IKA公司)。

1.2 试剂和材料吡布特罗、西马特罗、特步他林、齐帕特罗、沙丁胺醇、西布特罗、克伦塞罗、克伦丙罗、羟甲基克伦特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗、福莫特罗、溴布特罗、克伦潘特、班布特罗、马布特罗、马喷特罗，西马特罗-D7，沙丁胺醇-D3，莱克多巴胺-D3，克伦特罗-D9，班布特罗-D9，克伦潘特-D5，克伦丙罗-D7纯度均大于98.0%(Dr.Ehrenstorfer公司);乙腈、异丙醇、甲酸为色谱纯(Fisher公司);NaCl、Na2SO4和MgSO4均为分析纯;所用水为超纯水。

1.3 对照溶液配制精密称定适量的吡布特罗、西马特罗、特步他林、齐帕特罗、沙丁胺醇、西布特罗、克伦塞罗、克伦丙罗、羟甲基克伦特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗、福莫特罗、溴布特罗、克伦潘特、班布特罗、马布特罗和马喷特罗对照品，用甲醇配制成1 mg/mL的各标准储备液。准确吸取0.1 mL的各标准储备液至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得10 μg/mL的混合标准工作液。

精密称定适量的西马特罗-D7，沙丁胺醇-D3，莱克多巴胺 -D3，克伦特罗 -D9，班布特罗 -D9，克伦潘特-D5和克伦丙罗-D7，用甲醇配制成1 mg/mL的各内标储备液。准确吸取0.1 mL的各内标储备液至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得10 μg/mL的混合内标工作液。

1.4 样品前处理准确称取匀质的猪、牛和羊肌肉组织(5±0.05)g，置于50 mL离心管内，加入8 mL乙腈和2 mL异丙醇，涡旋1 min。加入1.2 g氯化钠，涡旋1 min，再加入4 g Na2SO4和0.5 g MgSO4，涡旋后水平振荡 5 min，静置 5 min，8000 r/min离心8 min。离心后取5.0 mL上清液于玻璃离心管内，50℃下氮气吹干，然后用10%甲醇水溶液0.5 mL充分溶解后，供超高效液相色谱-串联质谱法测定。

1.5 仪器分析条件色谱柱为BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm);流动相A相为0.1%甲酸乙腈溶液，B相为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱:0～2 min，维持4%A;2～12 min，4%A线性变化至60%A;12～13 min，维持 4%A;流速为0.3 mL/min;柱温为30 ℃;进样量为10 μL。

电喷雾离子源(ESI+);毛细管电压为3.2 kV;源温为110℃;脱溶剂温度为350℃;脱溶剂气速为650 L/Hr;锥孔反吹气速为50 L/Hr。多反应监测离子情况见表1。

2 结果

2.1 标准曲线与线性范围准确量取适量的西马特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗、班布特罗、克伦潘特、克伦丙罗7种混合标准工作液和内标工作液，制得浓度为 2、5、10、20、50 ng/mL 的系列标准工作溶液(内标浓度为10 ng/mL)，依次上机测定，以各药物定量离子质量色谱峰面积与对应的内标峰面积比值为纵坐标(y)，标液浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线(表2)。可以看出7种β-受体激动剂在2～50 ng/mL的系列标液浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.99。

其他12种β-受体激动剂取其混合标准工作液适量，分别添加到空白肌肉组织经前处理后的基质中，制得浓度为 2、5、10、20、50 ng/mL 的系列基质匹配标准溶液，依次上机测定。以各药物定量离子质量色谱峰面积为纵坐标(y)，基质匹配标准溶液浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线(表2)。可以看出12种β-受体激动剂在2～50 ng/mL的系列浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.99。

表1 19种β-受体激动剂及内标监测离子对、对应的锥孔电压和碰撞能量

表2 19种β-受体激动剂标准曲线及相关系数

2.2 方法灵敏度采用空白添加目标化合物的方法，依据特征离子质量色谱峰信噪比S/N＞3为方法检测限，S/N＞10为方法定量限，得出吡布特罗、西马特罗、特步他林、等19种药物在猪、牛和羊肌肉组织中的定量限为0.5 μg/kg，检测限为0.25 μg/kg。

1 μg/kg空白猪肌肉添加试液中19种β-受体激动剂特征离子质量色谱图见图1。

图1 1 μg/kg空白猪肌肉添加试液中19种β-受体激动剂特征离子质量色谱图

2.3 方法精密度与准确度在空白猪肌肉中添加0.5、1、5 μg/kg三个不同浓度的19种 β-受体激动剂进行回收率试验，结果汇总见表3。可以看出，19种β-受体激动剂在空白猪肌肉组织中的平均添加回收率为73.7% ～114.1%，批内批间相对标准偏差均小于20%。

表3 空白猪肌肉中19种β-受体激动剂添加回收率实验结果(n=5)

3 讨论

β-受体激动剂在养殖业上属于禁用药物，对于此类药物，只要在动物性食品中检出即为非法添加，已报道的文献[1-7]资料中，此类药物的分析方法都包括酶解、液液萃取、固相萃取净化等繁琐的前处理过程，药物绝对回收损失较大，且耗时较长。因此，本方法采用乙腈和异丙醇(4∶1，V/V)为提取溶剂进行提取，对于苯胺型、苯酚型及间苯二酚型的药物均有好的提取效果。此外，方法中加入NaCl、Na2SO4和MgSO4，具有很好的盐析沉淀蛋白、去杂、吸收水分等作用，起到了很好的样品净化效果。本方法缩短了样品前处理时间，能更好地满足快速确证检测的需求。