环巴胺对人胃癌SGC-7901细胞中β-catenin及E-cadherin基因表达的影响

任雪萍 姜 藻 张全安

我们以人胃癌SGC-7901细胞为研究对象，观察环巴胺对胃癌细胞生长和β-catenin、E-cadherin基因表达的影响，初步探查其抗肿瘤的机制，为胃癌治疗寻找新靶点，为环巴胺临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌细胞株SGC-7901购自中国科学院上海细胞生物学研究所;环巴胺(Cyclopamnie)购自Biomol公司;RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、AO/EB染色试剂盒购自Sigma公司;细胞周期试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司;β-actin及β-catenin、E-cadherin基因引物购自Invitrogen公司;RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人胃癌细胞株SGC-7901细胞在5%CO2、37℃条件下，用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)及链霉素(100 μg/ml)的RPMI-1640培养液培养，每3天传代1次，取对数生长期细胞实验。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制情况 用胰酶消化细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×104/ml，接种于96 孔培养板中，每孔 200 μl，在 37℃、5%CO2的饱和湿度条件下孵育过夜。实验分为实验组、阴性对照组及空白对照组，实验组加入终浓度分别为5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、120 μmol/L的环巴胺，每组设3个复孔。各组分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，继续培养4 h，离心弃上清，每孔加入 DMSO 150 μl，振荡器上振荡10 min，混匀后应用酶联免疫检测仪于490 nm波长处测吸光度(A)值，细胞存活率(%)=(药物干预组A平均值/阴性对照组A平均值)×100%。实验重复3次。

1.2.3 AO/EB染色荧光显微镜观察细胞凋亡 取对数生长期SGC-7901细胞，胰酶消化制成单细胞悬液，接种于六孔培养板中，培养过夜后加入终浓度为20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L 的环巴胺，另设阴性对照组，继续培养24 h。收集各组细胞，调整细胞浓度为106/L;取100 μl细胞悬液，加入5 μl混合荧光染液:100 μg/ml丫碇橙(AO)和 100 μg/ml嗅乙啶(EB)混匀;取上述混合液一滴，滴在洁净玻片上，加盖玻片后立即置荧光显微镜下观察凋亡细胞形态。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡周期 取对数生长期的SGC-7901细胞接种于100 ml培养瓶中，分别加入终浓度为 20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L 的环巴胺，作用24 h后，收获各组细胞制成单细胞悬液，4℃PBS洗涤3次，细胞重悬于预冷的80%乙醇中，吹打均匀，4℃储存过夜，离心细胞，PBS洗涤细胞3次。依次加入100 μl Rnase A 及 PI，4℃ 避光染色 30 min，应用流式细胞仪测定细胞周期，实验重复3次。

1.2.5 RT-PCR 法检测 β-catenin、E-cadherin mRNA表达 分别收集经 20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的环巴胺作用24 h的细胞及空白对照组细胞。按TRIzol试剂盒说明书提供的方法提取各组细胞总RNA，按RT-PCR试剂盒说明书提供的方法将其反转录成cDNA，以此cDNA为模板进行PCR扩增。β-catenin:上游引物为 5＇-CCCACTAATGTCCAGCGTTT-3＇，下游引物为5 ＇-TCACGATGATGGGAAAGGTT-3 ＇，产物长度为323bp;E-cadeherin:上游引物为 5＇-GGCCAGGAAATCACATCCTA-3＇，下游引物为5 ＇-GTGCAGTGGCTCATGTCTGT-3＇，产物长度为407 bp;β-actin:上游引物为5-AGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTT-3＇，下游引物为 5 ＇-GAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGC-3 ＇，产物长度为600 bp。PCR扩增条件:94℃ 2 min，94℃30 s，59℃ 30 s，72℃ 40 s，30 个循环，72℃ 延伸7 min。RT-PCR产物进行琼脂糖电泳，凝胶成像系统拍照，分析灰度值。实验重复3次。

1.3 统计学处理

实验所得数据以均数 ±标准差表示，应用SPSS13.0软件包进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用SNK检验。

2 结果

2.1 环巴胺对人胃癌SGC-7901细胞的生长抑制作用

表1 环巴胺对人胃癌SGC-7901细胞的抑制作用(±s，%)

表1 环巴胺对人胃癌SGC-7901细胞的抑制作用(±s，%)

注:与对照组比较，▲为P＜0.05;相同时间点组内或相同剂量组内两两比较，★为 P＜0.05。

环巴胺浓度(μmol/L)生长抑制率24 h 48 h 72 h 0 0 0 0 5 5.66 ±0.67▲ 9.89 ±0.31▲ 14.76 ±0.84▲★10 11.75 ±0.99▲★ 16.79 ±0.54▲★ 22.03 ±0.78▲★20 19.19 ±0.37▲★ 25.68 ±1.23▲★ 31.01 ±0.36▲★40 35.07 ±1.69▲★ 46.06 ±0.79▲★ 54.55 ±1.37▲★80 58.49 ±1.34▲★ 68.73 ±2.46▲★ 79.76 ±0.82▲★120 69.36 ±1.60▲★ 80.14 ±1.36▲★ 89.19 ±1.20▲★

由表1可见，不同浓度的环巴胺作用于人胃癌SGC-7901细胞24、48、72 h后，细胞生长受到不同程度抑制。随着环巴胺浓度的增加及作用时间的延长，其生长抑制作用增强，环巴胺的作用强度与剂量和作用时间成呈正相关，药物组与对照组比较以及各药物组间比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 AO/EB染色荧光显微镜下观察细胞凋亡

荧光显微镜下可见，正常阴性对照组细胞结构正常，核染色质着均匀绿色。环巴胺实验组可见早期凋亡细胞，细胞缩小、变圆，边缘毛糙，核染色质着亮绿色呈固缩状或圆珠状，位于细胞的一侧;同时可见晚期凋亡细胞，核染色质呈桔红色，浓聚和偏向。随着环巴胺浓度的增加，早期凋亡及晚期凋亡细胞增多。

2.3 环巴胺对人胃癌SGC-7901细胞周期的影响

人胃癌SGC-7901细胞经不同浓度环巴胺作用24 h后，细胞周期中DNA合成前期(G0/G1期)的比例增高，DNA合成期(S期)的比例降低，G2/M期变化不明显，G1周期前出现凋亡峰，细胞阻滞在G0/G1期，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，各药物组间比较差异也有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

2.4 环巴胺对SGC-7901细胞中E-cadherin、β-catenin基因表达的影响

RT-PCR结果表明在人胃癌细胞SGC-7901中存在E-cadherin、β-catenin mRNA异常表达。与阴性对照组相比，经20μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L 的环巴胺作用24 h后，E-cadherin mRNA的表达水平上调，β-catenin mRNA的表达水平下调。在图像处理系统上分析得出各基因产物的光密度，以β-actin的光密度值为参照物，得到E-cadherin、β-catenin mRNA表达的半定量结果。此结果显示随着环巴胺浓度增加，E-cadherin mRNA表达水平增高越明显，β-catenin mRNA表达水平下降越明显，与对照组比较差异有显著性(P＜0.05)，见图1。

表2 环巴胺作用于SGC-7901 24 h后细胞周期变化情况(±s，%)

表2 环巴胺作用于SGC-7901 24 h后细胞周期变化情况(±s，%)

注:*为不同浓度环巴胺作用后G0/G1期比较，P＜0.05;且两两比较有统计学意义，P＜0.05。

环巴胺浓度(μmol/L)细胞周期G0/G1期 S期 G2/M期0 51.79 ±1.45*11.02 ±1.34 7.01 ±1.37 39.32 ±1.56 8.89 ±1.32 20 58.01 ±1.33* 33.93 ±1.24 8.06 ±0.54 40 67.69 ±2.01* 24.46 ±1.11 7.85 ±1.68 80 81.97 ±2.11*

图1 不同浓度环巴胺作用SGC-7901细胞24 h后E-cadherin和β-catenin mRNA的表达变化

3 讨论

本试验以人胃癌细胞SGC-7901为研究对象，MTT比色法结果显示环巴胺对SGC-7901细胞的增殖有显著抑制作用，其作用强度与剂量和作用时间呈正相关。荧光显微镜下观察到典型的凋亡细胞形态。流式细胞分析结果显示，与阴性对照组相比，环巴胺处理组G0/G1期细胞所占比例随着浓度的增加逐渐上升，而S期细胞的比例则随着浓度的增加逐渐下降。环巴胺将细胞阻滞在G0/G1期，抑制细胞DNA前期的合成，阻滞细胞进入周期复制，从而引起细胞凋亡。

胃癌浸润和转移是一个复杂的过程，目前研究表明，Wnt信号通路参与胃癌形成，在大多数胃癌中被激活［1］。Wnt信号通路是自我更新信号通路之一，与肿瘤的发生发展、侵袭转移密切相关，Wnt信号通路的下游靶基因包括 CD44、MMP-7、cylinD1、c-Myc、Claudin-1等［2］。β-连环蛋白(β-catenin)是 Wnt信号通路的正向调节因素及重要的效应分子。正常发育成熟细胞β-catenin处于低或无表达状态，Wnt信号通道处于关闭状态;β-catenin的异常表达可引起Wnt信号通路的异常激活，从而引起其下游靶基因的异常激活，进而诱发细胞癌变［3］。韩竞春等［4］应用免疫组化、RT-PCR和Western蛋白印迹等方法在胃癌组织和细胞系中检测Wnt信号途径的状态，结果显示Wnt-2、β-catenin和TCF4在胃癌组织中的表达明显高于癌前病变组织，Wnt信号通路呈活化状态。Cheng等［5］在大部分中国胃癌组织(包括肠型和弥漫型胃癌)中都检测到β-catenin异常的核内积聚，与淋巴结转移、远处转移及肿瘤分期呈正相关。Zhang等［6］结果显示β-catenin表达在胃癌组织中的表达显著高于正常组织，且其表达水平与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期相关。本研究胃癌细胞SGC-7901中β-catenin mRNA呈异常高表达，经 20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L 环巴胺处理24 h后，β-catenin mRNA表达水平逐渐下降，本试验结果表明在胃癌细胞SGC-7901中存在Wnt信号通路的激活，环巴胺可能通过下调β-catenin的表达而抑制Wnt信号通路，进一步下调各种靶基因的转录，从而发挥抗肿瘤作用。

上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)是细胞间黏附连接的主要分子，可与细胞内的连环蛋白(主要为β-catenin)结合形成钙黏附素－连环蛋白复合体，从而介导细胞间黏附，其阳性表达可以抑制肿瘤转移［7］。正常胃黏膜上皮E-cadherin呈强阳性表达。低表达或失活的E-cadherin导致细胞黏附功能降低或丧失，一方面使得肿瘤细胞易发生浸润和转移;另一方面可释放βcatenin，胞内游离的β-catenin增加，从而激活Wnt信号通路，使细胞发生转化［8］。Sun等［9］应用免疫组化法检测58例胃癌组织、40例癌前病变胃组织和42例慢性非萎缩性胃炎组织，结果显示胃癌组织中β-catenin的表达明显高于癌前病变胃癌组织和慢性非萎缩性胃炎组织，E-cadherin表达水平明显低于癌前病变胃组织和慢性非萎缩性胃炎组织。Yuan等［10］应用免疫组化检测165胃癌组织，结果表明在胃癌组织中E-cadherin蛋白表达水平显著降低。Xing等［11］进行的一项荟萃分析，评估了26项研究包括4 383例胃癌患者E-cadherin的免疫组化表达和总生存期与临床病理特征的关联，结果显示E-cadherin表达下调与TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、分化程度、血管侵犯和胃癌的组织学类型相关，是胃癌不良预后因素。本实验研究结果显示，在胃癌细胞SGC-7901中，E-cadherin mRNA 呈低表达，经 20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L环巴胺处理24 h后，E-cadherin mRNA表达水平逐渐上升，与对照组相比具有统计学意义。E-cadherin基因表达上调，一方面增强了细胞间的黏附作用，另一方面使胞内游离的β-catenin降低，核内转移减少，从而可能进一步抑制Wnt信号通路，这可能是环巴胺诱导SGC-7901细胞凋亡的又一分子机制。

本试验证实，在胃癌细胞 SGC-7901中存在βcatenin、E-cadherin的异常表达，环巴胺可抑制胃癌细胞生长并诱导凋亡，其机制可能与引起G0/G1期阻滞以及调节以上2种基因的表达有关。

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