KPC1和胞质p27Kip1在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义

吴爱民，韩云，陈燕，周红

(南通市第一人民医院妇产科，江苏南通226001)

卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，但死亡率却超过了后两者之和，严重威胁女性的健康。p27Kip1是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制蛋白之一，在细胞核中能够与细胞周期蛋白E-CDK2结合，发挥阻滞细胞周期的作用［1］，作用于包括卵巢癌在内的多种肿瘤细胞［2］。已有研究显示，胞质中的p27Kip1与卵巢癌的不良预后相关［3］。Kip1泛素-促进复合体 1(Kip1 ubiquitination-promoting complex，KPC1)是一种E3泛素酶复合体亚基之一，能够降解从胞核转运至胞质中的 p27Kip1［4］。

本研究拟采用免疫组织化学法检测卵巢癌组织中KPC1和胞质p27Kip1的表达情况，并分析其表达与患者临床病理因素之间的关系。

1 材料和方法

1.1 组织标本

收集2008年1月至2011年12月于我院妇产科行手术切除，经病理证实、甲醛固定、石蜡包埋的卵巢癌切片标本64例;患者年龄32～77岁(平均61岁)，术前均未做任何辅助性治疗。病理资料如下:高分化14例，中分化31例，低分化19例;浆液性癌36例，黏液性癌14例，子宫内膜样腺癌8例，透明细胞癌6例;发生转移40例，未发生转移24例;有腹腔积液21例，无腹腔积液43例。

1.2 抗体

兔抗人p27Kip1多克隆抗体购自 Santa Cruz公司，鼠抗人KPC1单克隆抗体购自Abcam公司，二抗及DAB显色试剂盒购自Dako公司。

1.3 免疫组织化学分析

病理组织切片置于60℃烤箱烘烤6～8 h，然后经二甲苯脱蜡、梯度乙醇(浓度由高到低)水化后，高压锅柠檬酸盐(pH=6.0)修复抗原。室温孵育一抗(KPC1，1 ∶100;p27Kip1，1 ∶500)2 h，洗涤。室温孵育二抗30 min，DAB显色液显色5 min，自来水冲洗终止反应。苏木素复染细胞核，盐酸乙醇脱色。梯度乙醇(浓度由低到高)脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 免疫组织化学评分

采用Leica正置显微镜拍摄。切片阳性表现为细胞核和(或)细胞质出现棕黄色颗粒，阴性对照则无棕黄色反应物出现，仅仅细胞核染成蓝紫色。所有切片评价由笔者和两位未知患者资料的病理专家独立进行，三者评价综合考虑作为该切片的染色分级。

KPC1阳性表现为广泛胞质着色。根据切片的染色深度分为不同的等级:0，无着色;1，轻度着色;2，中度着色;3，重度着色。0和1为低表达，2和3为高表达。计数方法:每张切片选取5个有代表性的高倍镜视野(400×)，向同一个方向移动切片，不重复，不重叠。

p27Kip1阳性表现为细胞核和(或)细胞质出现棕黄色颗粒。评分按照阴性、核染和质染3种计算。胞质和胞核染色分开评分，不叠加。计数方法:每张切片选取5个有代表性的高倍镜视野(400×)，向同一个方向移动切片，不重复，不重叠，每个视野随机计数300个肿瘤细胞，共计算1 500个肿瘤细胞内的阳性细胞百分率。阴性定义为胞质不着色，阳性核＜5%;胞质染色分级同KPC1;当染色出现在胞核而不在胞质时，切片定义为“仅仅核染”。核染色定义 ＞5%为高表达，＜5%为低表达。

1.4 统计学处理

采用SPSS 15.0统计软件，数据采用 Pearson χ2检验，检验水准为α=0.05。采用Spearman相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌组织中KPC1和胞质p27Kip1的表达

免疫组织化学结果显示，KPC1呈胞质定位，低分化组织内可见密集棕黄色颗粒，呈强阳性表达;中分化组织内可见较多棕黄色颗粒，KPC1呈中等阳性表达;高分化组织内可见弥散分布的棕黄色颗粒，KPC1呈弱阳性表达。p27Kip1散在分布于组织切片内，呈胞核和(或)胞质定位，高分化组织中p27Kip1主要是胞核着色，胞质少见着色，而低分化组织中明显见到胞质着色。从不同组织病理类型来看，p27Kip1和KPC1在浆液性癌、黏液性癌及子宫内膜样癌中表达明显，而在透明细胞癌中几乎无表达。见图1和图2。

2.2 KPC1及胞质p27Kip1的表达与临床病理因素的相关性

如表1所示，KPC1表达与FIGO分期、肿瘤分化程度、病理类型、转移情况相关(P均＜0.05)，而与年龄、肿瘤残灶、腹腔积液等无相关性(P均＞0.05)。胞质p27Kip1的表达与患者的FIGO分期、肿瘤分化程度、病理类型相关(P均＜0.05)，而与年龄、转移情况、肿瘤残灶、腹腔积液等无相关性(P＞均0.05)。

图1 KPC1和p27Kip1在不同分化癌组织中的表达(400×)Fig 1 The expressions of KPC1 and p27Kip1in various differentiated neoplasm

图2 免疫组织化学检测KPC1和p27Kip1在上皮性卵巢癌组织中的表达(400×)Fig 2 Immunohistochemical analysis of KPC1 and p27Kip1expression in epithelial ovarian cancer

表1 KPC1和胞质p27Kip1的表达与上皮性卵巢癌临床病理参数间的关系Tab 1 The relationship between the expression of KPC1 and cytoplasmic p27Kip1 and the clinical pathological parameters of epithelial ovarian cancer

2.3 KPC1与胞质p27Kip1的相关性

KPC1和胞质 p27Kip1属于等级资料，采用Spearman相关分析显示，KPC1与胞质p27Kip1表达呈正相关(r=0.493，P ＜0.01)。

3 讨论

细胞周期紊乱是癌症进程中的首要事件。p27Kip1作为一种CDK抑制蛋白，能够阻滞细胞从G1期进入S期［1］，并且其表达丢失与各种肿瘤的进程有密切关系。p27Kip1转运至胞核外往往失去了周期抑制作用。在卵巢癌中，胞质亚细胞定位的p27Kip1在浆液组织中表达多于黏液组织。多因素生存分析显示，胞质p27Kip1而不是胞核p27Kip1，是独立的预后指标［3］。本研究检测了不同病理标本中p27Kip1的表达，结果显示，胞质p27Kip1在低分化组织中的表达较高分化组织高，其表达与肿瘤分化程度相关(P＜0.05)，与之前的研究结果一致［5］。

本研究结果表明，KPC1在卵巢癌细胞质中表达，肿瘤分化程度越低其表达深度越强。病理因素分析结果显示，KPC1与FIGO分期、肿瘤病理类型等因素有关(P均＜0.01)。此外，Spearman相关性分析结果显示，KPC1与胞质p27Kip1表达呈正相关(r=0.493，P ＜0.01)。上述结果提示，KPC1 与胞质中p27Kip1呈共表达。当细胞处于G1期时，有丝分裂信号刺激p27Kip1Ser10磷酸化，然后借助Jab1/CRM1由核内转运至胞质［6－7］;进而被一种未确定的E3泛素酶复合物泛素化，经由蛋白酶体降解。而在S期和G2期，胞核中周期蛋白 E-CDK2刺激p27Kip1Thr187磷酸化，SCFskp2使其泛素化，最后由蛋白酶体降解［8］。Kamura 等［4］发现，E3 复合体命名为Kip1泛素-促进复合体，由KPC1和KPC2两个亚基组成。KPC1是催化亚基，其羧基端环指结构域能够与胞质 p27Kip1相互作用，促进 p27Kip1泛素化［9］。KPC2发挥衔接蛋白的作用，参与p27Kip1多聚泛素化与26S蛋白酶体的传递［10］。机体内 p27Kip1的 mRNA表达在增殖细胞的整个细胞周期是恒定的，基于翻译后修饰的调节作用，其蛋白水平因所处周期的不同而不同。分化程度越高，胞核内Ser10发生磷酸化的p27Kip1表达越多，致使其出核转运增加，进而引起胞质中p27Kip1表达增加。胞质中p27Kip1在Tyr74和Tyr78发生磷酸化后重新进入胞核，而KPC1促进胞质p27Kip1泛素化降解，负反馈抑制入核，扰乱了出入核平衡，从而促进了肿瘤细胞异常增殖。

本研究综合考查了胞质p27Kip1与其降解蛋白KPC1的表达关系。研究结果提示，二者共表达的上皮性卵巢癌组织的分化程度差，病情严重。

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