幽门螺杆菌cag1基因缺陷株的构建与鉴定

凌峰，王晓春，陈珵，余敏，朱虹，罗彩凤，邵世和

(1.江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏镇江212013;2.昆山市中医医院检验科，江苏苏州215300;3.江苏大学临床医学院，江苏镇江212013)

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)为人类胃部常见致病菌之一，其感染在世界范围内流行。H.pylori感染与多种胃肠道疾病的发生密切相关，如胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤［1］。高致病性H.pylori存在一个细胞毒素相关基因致病岛(cytotoxin associated gene pathogenicity island，cag PAI)结构，编码重要的 H.pylori相关毒力蛋白和1种Ⅳ型分泌系统［2］。该Ⅳ型分泌系统中的部分蛋白与根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens，A.tumefaciens)的经典Ⅳ型分泌系统——VirB/D4系统存在同源性［3］。目前仍有许多cag PAI基因编码蛋白仅存在于H.pylori中，且功能未知，cag1基因即为其中之一。

本研究以cag PAI首个编码基因cag1作为研究对象，拟用同源重组技术构建cag1基因缺陷的自杀质粒;通过电击转化细菌，抗性筛选出cag1基因缺陷株，并将其破坏GES-1细胞的能力与野生株进行比较。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、细胞株与质粒 H.pylori NCTC11637由中国疾病预防控制中心传染病研究所张建中教授馈赠，人胃上皮GES-1细胞由江苏大学周天戟教授馈赠，H.pylori自杀质粒pBluescript SKⅡ(-)载体由韩国国立庆尚大学微生物学教研室Seung-chul Baik教授馈赠。大肠埃希菌(E.coli)DH5α由江苏大学基础医学与医学技术学院实验室保存。

1.1.2 主要试剂 哥伦比亚培养基、微需氧袋、胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司;小牛血清购自杭州四季青生物工程材料生物公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris)、SDS购自国药集团化学试剂有限公司;平衡酚、RNA酶购自Generay生物公司;1 000 bp DNA标准参照物、限制性核酸内切酶EcoR I、BamH I、Kpn I、Xho I购自 Thermo公司;DL2000 DNA 标准参照物、Taq DNA聚合酶、dNTP、T4DNA连接酶、胶回收试剂盒购自TaKaRa公司;引物由上海英潍捷基生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要仪器 核酸检测仪(Eppendorf公司);基因扩增仪(Applied Biosystems公司);凝胶成像系统(Syngene公司);高速冷冻离心机(Heraeus公司);恒温水箱(上海医疗器械公司);摇床(上海福玛实验设备有限公司);电穿孔仪(Bio-Rad公司);电泳仪(南京驰顺科技有限公司);CO2细胞培养箱(Thermo公司);倒置生物显微镜系统(Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1 cag1基因两侧同源臂的扩增 根据基因库中的H.pylori全基因组序列，设计cag1基因上游和下游同源臂序列F1、F2的引物(表1)，cag1基因全长348 bp，引物P1/P2用于扩增F1，引物P3/P4用于扩增F2。以H.pylori NCTC11637基因组DNA为模板，进行PCR扩增。扩增条件:95℃ 5 min，95℃30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35 个循环，72 ℃10 min;PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后通过凝胶电泳图像分析系统分析鉴定，使用胶回收试剂盒回收产物，－20℃保存。

表1 引物序列Tab 1 Sequence of primers

1.2.2 自杀质粒 pBluescript/Δcag1 ∶∶Kmr的构建

胶回收上下游同源臂片段与pMD-18T载体，通过T4DNA连接酶4℃连接16 h。将连接后的混合物，通过热击转化入 E.coli DH5α，然后涂布于含100 μg/mL氨苄西林的LB固体培养基，37℃培养12 h。长出阳性菌落后，挑下继续接种于含100 μg/mL氨苄西林的LB液体培养基内，37℃振摇过夜，按照分子克隆指南中碱裂解法抽提细菌质粒，并进行酶切鉴定。胶回收上下游同源臂F1与F2，酶切两个片段与含卡那霉素抗性(Kmr)片段的pBluescript载体，分步进行连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，转化后涂布于含50 μg/mLKmr的LB平板上，37℃培养12 h，挑取单个菌落接种于含50 μg/mLKmr的LB液体培养基，37℃振摇过夜后抽提质粒，进行酶切鉴定，构建自杀质粒pBluescript/Δcag 1 ∶∶Kmr。

1.2.3 cag1基因缺陷株的构建 H.pylori NCTC11637在哥伦比亚固体培养基上培养72 h后，刮取细菌至1 mL 10%蔗糖与甘油的混合溶液，4℃ 5 000 r/min离心10 min(重复3次);沉淀重悬于100 μL 10%蔗糖甘油混合溶液中，4℃或冰上孵育10～15 min;加自杀质粒约25 μg，4℃或冰上再次孵育5～10 min;移入冰预冷的0.2 cm规格大小的电击杯，准备点击转化。将电击杯放入电击仪器上的正确位置，确保正负极连接正确，将仪器工作条件设为25 F，2.5 kV，200 Ω，电击5 s后，立即将电击杯中的液体全部均匀涂布于含12.5 μg/mL卡那霉素的哥伦比亚平板上，37℃微需氧培养72 h。

收集培养细菌后进行尿素酶以及细菌革兰染色鉴定，提取基因组DNA进行PCR鉴定。以上游同源臂F1的上游引物P1和下游同源臂F2的下游引物P4，进行 PCR扩增。反应条件:94℃ 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环，72 ℃10 min，以野生株作为PCR扩增对照。扩增结果送上海英潍捷基生物工程公司测序。鉴定无误后，证明突变株构建成功，将其命名为Δcag1。

1.2.4 胃上皮 GES-1细胞与 H.pylori野生株及cag1基因缺陷株共培养 胃上皮GES-1细胞按照常规方法培养2 d，H.pylori野生株和缺陷株Δcag1按照微需氧方法培养3 d，然后按照MOI=300∶1的比例，于细胞中加入细菌，培养8 h。倒置显微镜观察细胞形态。

2 结果

2.1 cag1基因两侧同源臂的制备

以H.pylori NCTC11637基因组DNA为模板，引物P1/P2、P3/P4分别用于扩增上游同源臂F1(598 bp)和下游同源臂F2(737 bp)。扩增产物见图1。

图1 cag1基因上下游同源臂PCR产物Fig 1 PCR amplification of F1 and F2 fragments of cag1 gene

2.2 cag1基因缺陷自杀质粒的构建与酶切鉴定

自杀质粒 pBluescript/Δcag1∶∶Kmr由上下游同源臂与pBlueKM40载体连接后构建完成，进行酶切鉴定。经KpnⅠ、XhoⅠ双酶切后，出现约598 bp片段，即为F1片段;经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后，出现约737 bp片段，即为F2片段;经KpnⅠ、BamHⅠ酶切后，出现约2 700 bp大小的片段，即为F1、F2、Kmr基因相加片段。符合设计结果。见图2。

图2 自杀质粒的酶切鉴定Fig 2 Identification of the suicide vector by restricted enzyme digestion

2.3 cag1基因缺陷株的鉴定

使用野生株、经卡那霉素筛选的阳性细菌为模板，通过cag1基因同源臂F1上游引物P1和F2下游引物P4作PCR鉴定。结果显示，野生株PCR产物约为1 400 bp，缺陷株PCR产物约为2 700 bp，与设计结果相符。扩增产物测序结果也符合预期结果，证明cag1基因缺陷株构建成功。见图3。

图3 H.pylori cag1基因缺陷株的产物鉴定Fig 3 Identification of H.pylori cag1 gene mutant

2.4 H.pylori野生株和cag1基因缺陷株与GES-1细胞共培养后细胞形态的变化

H.pylori NCTC11637野生株和cag1基因缺陷株分别与GES-1细胞共培养8 h的结果显示，野生株感染后的细胞几乎都被破坏，无正常形态，出现破碎、分散、延长和不规则变化的现象;而cag1基因缺陷株感染的细胞更接近于未感染细胞，仍存在大量梭形的正 常细胞，较少出现细胞破坏的现象。见图4。

图4 GES-1细胞与H.pylori野生株和cag1基因缺陷株共培养后的形态学观察Fig 4 Morphological image of GES-1 cells infected with the H.pylori wild-type strain and cag1 gene mutant strain

3 讨论

H.pylori是胃部疾病的重要病原体，其全球感染率高达50%，已成为世界重大公共卫生问题。国际癌症研究机构(IARC)将其列为第一类致癌原［4］。近期文献报道了cag PAI及其编码的相关毒力蛋白CagA 在 H.pylori感染致病中的重要性［5－6］。流行病学研究证明，cag PAI阳性的H.pylori菌株致病性明显高于cag PAI阴性株［7］。整个cag PAI区域长达35 000 ～40 000 bp，包含29 ～31 个基因［8－9］。其编码蛋白构成一种类似菌毛样结构的Ⅳ型分泌系统，该结构伸出细菌表面，可将毒力因子注入宿主细胞［10］。该Ⅳ型分泌系统的蛋白中有11个与A.tumefaciens中的经典 VirB/D4系统同源［3］。

目前，关于cag1基因功能的研究甚少。但在H.pylori感染的胃组织标本中，cag1基因表达水平极高。与其相似的高表达基因还有尿素酶基因和过氧化氢酶基因等，上述基因功能与细菌存活和生长密切相关，说明在恶劣环境下cag1基因可能对维持细菌存活具有重要的作用［11］。生物信息学分析结果显示，cag1编码蛋白存在信号肽，在N端第21和22个氨基酸位置有切割位点，并且预测其可能是一种新型的分泌蛋白［12］。

本研究以cag PAI首个编码基因cag1作为研究对象，利用同源重组原理，构建cag1基因的缺陷株。选用克隆质粒 pBluescript SKⅡ(-)构建自杀质粒，并在载体中插入一个含启动子的Kmr基因片段，采用PCR方法扩增得到cag1基因两侧片段F1(598 bp)与F2(737 bp)，作为同源臂连接于载体抗性基因片段的上下游，成功构建cag1基因缺陷自杀质粒［13］。采用电击转化技术将该质粒转化入野生株。由于pBluescript SKⅡ(-)在H.pylori中无法复制，但具有自杀性，致细菌染色体与载体发生同源重组，使Kmr基因置换野生株的cag1基因，通过 Kmr筛选cag1基因敲除的缺陷株 pBluescript/Δcag1∶∶Kmr得以建立，并用 PCR方法鉴定该缺陷株。H.pylori感染宿主细胞后，会诱导细胞形态发生变化，导致细胞死亡。这种细胞形态延长的变化称为蜂鸟样改变。为了检测cag1基因缺失对细菌毒力的影响，在获得cag1基因缺陷株后，观察H.pylori野生株和cag1基因缺陷株与GES-1细胞共培养后细胞形态的变化。结果显示，野生株感染细胞后8 h，细胞破碎、分散、延长且形态不规则;而cag1基因缺陷株感染后，细胞大多形态正常。以上结果说明，cag1基因缺失后，共培养的GES-1细胞破坏减少。因此，我们认为cag1基因缺失使H.pylori的毒力减弱，但毒力减弱的具体机制尚有待进一步研究。

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