绵羊肺腺瘤病毒内蒙株衣壳蛋白在真核细胞中的表达

斯日古楞，么宏强，马学恩，周建华

（1.内蒙古农业大学兽医学院 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古 呼和浩特010018；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨150030）

绵羊肺腺瘤病毒（JSRV）gag基因所编码的衣壳蛋白（CA）是JSRV的主要核心蛋白，构成病毒粒子双层壳的内壳－即衣壳，具有疏水性，其氨基酸序列比较保守，在感染晚期对病毒的装配和出芽发挥重要功能［1］。CA抗原不仅在不同毒株中高度保守，而且在病毒粒子中含量高且容易制备，因此CA蛋白一直被选作为商品化诊断抗原。

使克隆的基因在细胞中表达在理论研究和实际应用中都具有十分重要的意义。克隆的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能以及其表达调控的机理，克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。为了进一步研究CA蛋白的结构和功能等奠定基础，本试验中构建其真核表达载体，实现了在真核细胞中的高效表达，并对表达的蛋白进行了有效鉴定。报告如下。

1 材料

1.1 菌株与质粒E.coliDH5α感受态细胞、pcD－NA3.1（＋）真核表达载体等，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。重组原核表达质粒，本课题组保存。

1.2 细胞 293细胞和Hela细胞，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。

1.3 抗体 抗HA小鼠单抗（TIANGEN）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG（北京中山金桥生物技术有限公司）；FITC标记的山羊抗小鼠IgG（Sigma公司）。

1.4 培养基 DMEM培养基（Sigma公司）；优级胎牛血清（天津市灏洋生物制品科技责任有限公司）；0.25%胰酶、2mmol/L L－谷氨酰胺、青霉素、链霉素等均为国产分析纯试剂。

1.5 主要试剂 LipofectamineTM2000脂质体转染试剂（Invitrogen公司）；质粒提取试剂盒 （Promega公司）；PrimerSTARTMHS DNA聚合酶、5×PrimerST ARTM Buffer、限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ、XhoⅠ、T4DNA Ligase（宝生物工程（大连）有限公司）；Western Blotting ECL超敏发光液（普利莱基因技术有限公司）；LB培养基及其余生化试剂均为国产或进口的分析纯试剂。

2 方法

2.1 重组真核表达载体的构建 重组原核表达质粒经PCR法及EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶进行双酶切鉴定，并以其为模板，采用含HA标记序列的引物及PrimerSTARTMHS DNA高保真聚合酶进行PCR扩增。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

胶回收纯化的PCR产物和真核表达载体pcDNA3.1（＋），双酶切纯化后，连接转化入E.coliDH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素LB平板，37℃培养过夜。提取的重组质粒经PCR及双酶切鉴定。阳性克隆进行核苷酸序列的测定。

2.2 pcDNA3.1（＋）－CA－HA 在真核细胞中的瞬时表达

2.2.1 转染真核细胞 将293细胞和Hela细胞用含10%FBS的DMEM培养基，在37℃，5%CO2的条件下，进行贴壁培养2～3d后，再消化传代培养。转染前在6孔板每孔铺5×105个细胞，培养过夜。第2天，采用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂进行转染。

2.2.2 检测pcDNA3.1（＋）－CA－HA 在真核细胞中的表达

2.2.2.1 间接免疫荧光法检测 将转染后的细胞培养至35h时，用PBS洗涤，并用预冷的无水乙醇在室温固定20min；PBS洗涤，将一抗（HA单抗）滴加于固定细胞上，室温孵育2h；PBS洗涤3遍，每次5min；加入FITC标记山羊抗小鼠IgG二抗室温孵育1h，PBS洗涤3遍，每次5min。空载体转染的细胞为阴性对照；未转染pcDNA3.1（＋）－CAHA质粒的293细胞和Hela细胞为空白对照。倒置荧光显微镜下观察转染细胞中荧光强度。

2.2.2.2 Western Blotting法检测 将转染后的细胞培养至18h、24h、36h和48h时，用PBS洗涤，应用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，进行SDS－PAGE电泳；应用转膜仪将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉4℃封闭过夜；废弃封闭液，加入一抗，室温孵育2h；用TBST洗膜3次，每次5min；再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育1h；用TBST洗膜3次，每次5min；加入Western Blotting超敏发光液，用化学发光法在成像仪下曝光检测目的蛋白的表达情况。

3 结果

重组真核表达载体的构建

3.1.1 CA－HA基因的PCR扩增结果采用PCR法以原核表达质粒（经PCR及双酶切法鉴定）作为模板，进行扩增目的基因，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，符合预期片段大小585bp，见图1。

图1 CA－HA基因的PCR扩增

3.1.2 重组质粒的鉴定 采用PCR、酶切法鉴定重组质粒pcDNA3.1（＋）－CA－HA，之后对阳性的重组子进行序列测定。结果显示，目的基因序列与原序列完全一致，未发生突变，读码框架和插入方向完全正确。

检测pcDNA3.1（＋）－CA－HA在真核细胞中的瞬时表达

3.2.1 间接免疫荧光检测结果 重组质粒转染293细胞和Hela细胞35h后，用倒置荧光显微镜检测，可以看到绿色荧光细胞，且荧光都位于细胞膜，对照无荧光出现，见图2。此结果证实所克隆的CA基因，在异源启动子CMV的作用下，在真核细胞中可以表达，而且表达在细胞膜上。

3.2.2 Western blotting检测结果 转染后，分别在18、24、36、48h时裂解细胞，裂解产物经 Westhern blotting检测，结果显示，在25kDa处可见特异条带，而对照未检测到此条带，见图3，说明真核表达载体pcDNA3.1（＋）－CA－HA可在真核细胞中已成功表达了CA蛋白。

图2 间接免疫荧光方法检测CA－HA基因在293细胞和Hela细胞中的表达

图3 Western blotting方法检测在293细胞和Hela细胞中的表达

4 讨论

JSRV的衣壳蛋白（CA）是JSRV的主要核心蛋白，构成病毒粒子双层壳的内壳，它在病毒早期感染与脱衣壳过程中可以稳定未整合的前病毒DNA［2－3］，CA携带群特异抗原决定簇，其抗原性十分保守。反转录病毒感染细胞后，大多数情况下不会对宿主细胞造成损害，成为隐性感染，目前该病可能发生机制是由于病毒的LTR中所含病毒转录的启动子和增强子影响前病毒DNA插入宿主细胞，激活了宿主细胞的原癌基因，或造成抑癌基因的失活［4－5］。

本试验中，为了除去原核融合表达蛋白的GST标签并获得体外表达的具有类似天然病毒蛋白生物学活性的CA蛋白，构建了CA基因的真核表达载体并进行真核细胞内表达。因无相应的抗体及阳性血清可检测JSRVCA蛋白的表达，故在设计本试验时CA基因中融入HA序列，以便于检测目的基因的表达。经酶切鉴定及测序与预期一致基因序列比较分析结果显示，没有发生无义突变，已成功构建了含有CA基因的真核表达载体，并用该载体经脂质体法转染293细胞和Hela细胞后，通过间接免疫荧光方法及 Western blotting方法检测证实，该载体可在真核细胞内成功表达外源性目的基因CA，在荧光显微镜下，转基因阳性细胞内外源蛋白CA广泛分布于细胞膜上，并且 Western blotting检测结果表明，有特异的蛋白表达。因此，可以认为本试验所构建的真核表达载体是成功的。本试验对CA蛋白单克隆抗体进行初步鉴定、筛选，为建立特异性的诊断试剂盒奠定良好的基础。本结果为进一步研究CA蛋白的结构与功能，以及从分子水平探讨CA基因免疫等奠定了理论基础。

［1］ Tustin R C，Williamson A－L，York D F.Experimental transmission of Jaagsiekte（ovine pulmonary adenomatosis）to goats［J］.Onderstepoort J Vet Res，1988，50：309－316.

［2］ Brown P O.Integration of retroviral DNA［J］.Curr Top Microbiol Immunol，1990，157：19－48.

［3］ Brown P O.Integration［M］.In：Retroviruses（J M Coffin，S H Hughes and H E Varmus，Eds.），New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1997：161－203.

［4］ Deluca C，Kwon H，Pelletier N，etal.NF－K B protects HIV－1infected myeloid cells from apoptosis［J］.Virology，1998，244：27－38.

［5］ Carlson J，Bishop J，Lyon M，etal.Chromosomal distribution of endogenous Jaagsiekte sheep retrovirus proviral sequences in the sheep genome［J］.Journal of Virology，2002，75：4239－4246.