鸡胚脾脏石蜡切片制作及H.E.染色方法改良的探讨

王 铁，王子旭，陈耀星

（中国农业大学动物医学院，北京 海淀100193）

石蜡切片和H.E.染色，是组织学的最基本的技术之一，至今已使用了100多年［1］。石蜡切片是目前组织标本制作的方法之一，其特点是可进行多种染色，细胞及组织层次感好，且能长期保存完好的组织形态［2］。石蜡切片制作和染色过程中涉及的因素很多［3］，各个环节均需要操作者根据所制作的组织不同严格筛选试验条件［4］。已有大量文章进行石蜡切片方法学的研究，如组织固定不充分，会导致切片灰染［5］，脱蜡不彻底导致染色不良［6－7］，伊红复染时，要根据使用次数调节复染的时间［8］等，但并没有专门针对胚胎组织石蜡切片制作方法探讨的相关文章。本文选取脾脏为代表器官，目的是通过摸索制作鸡胚脾脏石蜡切片中脱水、透明、浸蜡、切片与染色的最佳条件，探讨制作优质鸡胚组织石蜡切片的方法。

1 材料与方法

1.1 样本获取 选用AA肉鸡受精卵16枚进行孵化，孵化期采用人工智能控温控湿，温度保持为37℃，湿度为50%～60%。分别在15胚龄（E15）和21胚龄（E21）摘取完整的鸡胚脾脏（n＝8）。取材后用4%多聚甲醛固定。

1.2 石蜡切片制作试验 鸡胚脾脏组织较小（约0.02g，最大直径约2mm），无需修块，整体脱水包埋。根据鸡胚胚龄的不同，分别设立四种脱水及透明方法，把脱水及透明分为进入乙醇浓度95%前和进入乙醇浓度95%后两个阶段，每个阶段分为快组（F）和慢组（S），每个胚龄共分为前快后快（F/F）、前慢后快（S/F）、前快后慢（F/S）和前慢后慢（S/S）四组。脱水、透明及浸蜡时间按照时间设置操作如表1所示。石蜡切片机切片，厚度为3～4μm，展片机水浴展片并烤干，常规H.E.染色。

表1 鸡胚脾脏脱水、透明、浸蜡流程

1.3 H.E.染色试验 根据最佳脱水及透明时间制作石蜡切片；脱蜡至水；室温20℃以上，用苏木精分别浸染20min、45min、3.5h；分色及蓝化，其中染色3.5h的一组用两次分色法，即短暂分色一次后自来水蓝化10min，然后二次分色至细胞质无色；常规脱水，伊红浸染，封片。

2 结果与分析

2.1 石蜡切片制作试验结果 15胚龄的鸡胚脾脏，前阶段低浓度乙醇脱水时间对切片质量影响不大。后期高浓度乙醇脱水及二甲苯透明的时间较短为好（见中插彩版图1B），时间较长组织因过度脱水，组织收缩严重，体积明显缩小，因过度失水导致组织变脆、切片有龟裂现象且着色较浅（见中插彩版图1CD）。21胚龄的鸡胚脾脏，前阶段低浓度乙醇脱水时间较长为好，时间过短则导致组织脱水不彻底，因影响了后期的透明和浸蜡，镜下细胞结构受损，透明时因二甲苯吸水作用较大，组织皱缩并出现龟裂现象（见中插彩版图1EG）。后期高浓度脱水及二甲苯透明时间较长为好（见中插彩版图1F），时间较短则透明不够，石蜡浸润不均匀，着色效果不好（见中插彩版图1H）。

2.2 H.E.染色试验结果 因胚胎细胞着色效果差，苏木精浸染20min、45min、均难以达到理想效果，经苏木精浸染3.5h并使用两次分色后，效果较为明显（见中插彩版图2）。

3 讨论

胚胎组织与生长期组织有一定区别，胚胎细胞多处于有丝分裂期，细胞核大且H.E.染色时苏木精着色效果较差。有研究表明，可将切片脱蜡至水后进行加热处理，可以改善着色效果［9］。但加热有可能改变组织抗原，进而影响免疫组化的效果。有研究表明，延长染色时间或加温染苏木素，再经2次或2次以上分色可提升染色效果［10］。本试验发现，苏木精浸染20min、45min，均难以达到理想效果，经苏木精浸染3.5h并使用两次分色后，效果较为明显。胚胎组织含水量大，组织块柔软细嫩，脱水时间不宜过长，常规脱水方法会导致组织变硬［11］，过分脱水会导致组织萎缩、变脆、龟裂［12］。本试验从30%酒精开始脱水，并适当缩短了脱水及透明的时间，并与常规脱水、透明的方法作比较，发现在鸡胚15胚龄高浓度乙醇脱水及二甲苯透明的时间较短为好，时间较长组织因过度脱水，组织收缩严重，体积明显缩小，组织因过度失水而变脆、切片有龟裂现象且着色较浅；鸡胚21胚龄时低浓度乙醇脱水时间较长为好，时间过短则导致组织脱水不彻底，因影响了后期的透明和浸蜡，镜下细胞结构受损，透明时因二甲苯吸水作用较大，组织皱缩并出现龟裂现象。后期高浓度乙醇脱水及二甲苯透明时间较长为好，时间较短则透明不够，石蜡浸润不均匀，着色效果不好。

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