矢车菊素在体外缓解脂肪变性的L02肝细胞的氧化损伤

屠 迪，易金娥，邬 静，文利新，2，薛立群

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙410128；2.长沙绿叶生物科技有限公司，湖南 长沙410128）

随着集约化饲养的发展，高能量日粮与极低运动量所诱发的氧化应激对养殖业发展的影响越来越严重，如何减少或缓解畜禽体内的氧化应激已经成为现代养殖业的重大课题。大部分具有抗氧化清除自由基的植物提取物均有缓解机体氧化损伤促进机体健康的能力。矢车菊素（Cyanidin，CY）是花青素（Anthocyanidin）的一种，广泛存在于植物中，属黄酮类（flavonoids）化合物。CY是纯天然的抗氧化剂，目前对CY的研究主要集中与抗肿瘤、调节神经系统等方面，此前的研究表明CY可以有效调节高能量日粮造成的脂代谢障碍，而其对脂代谢障碍时肝细胞氧化损伤的影响未见报道。CY对体外培养的细胞具有保护作用，该保护作用可能与其抗氧化能力有关。在体外CY通过下调TNF－α水平并减少活性氧（ROS）从而降低细胞的凋亡率［1］，抵抗TNF－α及双氧水所诱导的细胞凋亡［2］，并有效抵抗紫外线诱导的上皮细胞凋亡［3］。作者前期的研究发现，在体外CY有效降低脂代谢障碍肝细胞凋亡率，上述作用可能与CY的抗氧化应激作用有密切关系。因此，本试验采用人肝L02肝细胞制作脂代谢障碍模型并研究CY对此模型抗氧化能力的影响，为CY在脂代谢障碍过程中抗氧化应激研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验用CY、软脂酸（PA）和DMSO，购自Sigma公司；RPMI1640培养基为Gibco公司产品，胎牛血清（FBS）由杭州四季青公司生产，试验用L02人肝细胞系，购自中南大学湘雅医学院实验中心。

1.2 试验设计 首先参考熊清芳所述方法适当调整后制作脂代谢障碍模型［4］，具体方法为：在含有5%CO2饱和湿度条件下，以RPMI1640为培养基，培养体内含有 30mg/mL PA、0.5%DMSO 和10%FBS的条件下培养24h使L02细胞发生明显的脂肪变性。将L02细胞分为4组，1组为模型对照组，2、3、4组试验组。模型建立后更换造模培养基1次，各组培养体系内分别添加终浓度为0、0.01、0.1、1mg/mL的矢车菊素继续培养12h。

1.3 样品处理 试验结束后，用细胞刮刀刮下细胞，连同培养基一起收集后3 000r/min离心10min，收集沉淀细胞；采用RIPA强裂解液4℃裂解30min，每10min颠倒一次裂解液；4℃条件下12 000r/min离心5min，取上清液4℃待测。

1.4 测定指标与方法 测定各组细胞内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活性，丙二醛（MDA）含量以及总抗氧化能力（TAOC）。其中SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定；GSH－Px活性采用二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）法测定；MDA含量采用硫代巴比妥酸显色法测定；TAOC采用FRAP（化学比色法）测定。采用考马斯亮蓝（BCA）法测定样品中总蛋白含量。总蛋白、MDA、SOD、GSH－Px与 T－AOC测定试剂盒，均购自碧云天生物技术研究所。

1.5 数据分析和处理 采用SPSS 13.0软件进行数据处理，采用t检验分析组间差异显著性。

2 结果

2.1 CY对模型细胞SOD活性的影响 由图1可知，各试验组细胞中SOD活性较对照组均有所升高，并随着CY剂量的增加而增强，呈明显的量效递增关系。与对照组相比，第3组细胞内SOD活性升高显著（P＜0.05）而第4组L02细胞内SOD活性升高极显著（P＜0.01）。

2.2 CY对模型细胞GSH－Px活性的影响 由图2可知，在CY的作用下，各试验组L02肝细胞内GSH－Px活性均有所提高，但2、3组细胞内GSH－Px活性升高与对照组相比没有统计学上的差异，4组细胞内GSH－Px的活性升高相对显著（P＜0.05）。

2.3 CY对模型细胞内 MDA含量的影响 由图3可知，各试验组中MDA含量较对照组均有降低，并随着CY计量的增加呈现量效递减关系。与对照组相比，试验组2细胞内的MDA含量降低显著（P＜0.05），3、4试验组细胞内 MDA含量降低极显著（P＜0.01）。

2.4 CY对T－AOC的影响 由图4可知，各试验组L02肝细胞内T－AOC较对照组均有升高，并随着CY剂量的增加呈现明显的量效递增关系。与对照组相比，3组L02肝细胞内T－AOC水平升高显著（P＜0.05），4组L02肝细胞内 T－AOC水平升高极显著（P＜0.01）。

3 讨论

SOD和GSH－Px是机体内广泛存在的、重要的催化过氧化氢分解的酶。SOD可调节机体的氧化与抗氧化平衡，其活性高低反映了机体清除氧自由基能力的强弱，在机体抗氧化损伤、抗衰老与免疫调节过程中发挥重要作用［5］。GSH－Px是H2O2防御系统成员，可以清除活细胞内过氧化物，在保护细胞免受自由基损伤的过程中起着关键作用。试验结果表明，CY可以显著提高模型细胞内SOD和GSHPx水平，因此我们推断CY可以通过清除脂肪变性细胞内蓄积的过氧化氢，增强细胞抗氧化性。

MDA是不饱和脂肪酸过氧化产物之一。MDA含量可间接反映机体内的脂质过氧化水平，并作为氧化应激的生物标志物，并且和多种疾病的发生、发展有密切关系，是疾病早期严重程度的一个重要的标志物［6－7］。特别是在脂肪变性的肝细胞内，其水平保底直接反应细胞的过氧化水平［8］。生物膜中的不饱和脂肪酸易被自由基攻击而发生过氧化，导致结构和功能发生变化，这些变化势必影响细胞基本生命活动导致肝细胞功能障碍［9］。本试验中，CY可降低脂肪变性肝细胞内MDA含量，这表明CY可以通过降低脂质过氧化程度，增强脂肪变性肝细胞的抗氧化能力。

T－AOC代表细胞抗氧化能力的总和，是反应细胞抗氧化能力的重要指标［10］。其强弱与细胞所处状态有密切联系，当T－AOC降低时，会引起脂肪变性肝细胞的炎症反应［11］。本试验发现，CY能够显著提高脂肪变性L02细胞内T－AOC水平，随着CY计量的增加T－AOC水平逐渐升高，呈现显著的量效递增关系。此结果说明L02肝细胞内的各类抗氧化物质合成均得到增强，进而增强L02肝细胞的抗氧化能力。

4 结论

CY可以提高脂肪变性的L02肝细胞内SOD、GSH－Px活性和T－AOC水平，并降低细胞内MDA的含量进而增强L02肝细胞的抗氧化能力，降低脂肪变性所引起的氧化损伤。

［1］ Speciale A，Canali R，Chirafisi J，etal.Cyanidin－3－O－glucoside protection against TNF－alpha－induced endothelial dysfunction：involvement of nuclear factor－kappaB signaling［J］.J Agric Food Chem，2010，58（22）：12048－12054.

［2］ Guo H，Ling W，Wang Q，etal.Cyanidin 3－glucoside protects 3T3－L1adipocytes against H2O2－or TNF－alpha－induced insulin resistance by inhibiting c－Jun NH2－terminal kinase activation［J］.Biochem Pharmacol，2008，75（6）：1393－1401.

［3］ Ding M，Feng R，Wang S Y，etal.Cyanidin－3－glucoside，a natural product derived from blackberry，exhibits chemopreventive and chemotherapeutic activity［J］.J Biol Chem，2006，281（25）：17359－17368.

［4］ 熊清芳.FoxO3a在软脂酸诱导肝细胞凋亡中的作用及其机制的研究［D］.广州：中南大学，2010.

［5］ 蒋国军，路明珠，伊佳.原花青素对H2O2致PC12细胞氧化损伤作用的保护研究［J］.药学实践杂志，2009（6）：414－416.

［6］ Ueda S，Masutani H，Nakamura H，etal.Redox control of cell death［J］.Antioxid Redox Signal，2002，4（3）：405－414.

［7］ Eyer P，Podhradsky D.Evaluation of the micromethod for determination of glutathione using enzymatic cycling and Ellman′s reagent［J］.Anal Biochem，1986，153（1）：57－66.

［8］ 孟雪莲，曾晓非，孙祖越，等.丹参致大鼠肝细胞脂质过氧化损伤的实验研究［J］.辽宁大学学报（自然科学版），2005（1）：31－33.

［9］ Hassimotto N M，Genovese M I，Lajolo F M.Absorption and metabolism of cyanidin－3－glucoside and cyanidin－3－rutinoside extracted from wild mulberry （Morus nigra L.）in rats［J］.Nutr Res，2008，28（3）：198－207.

［10］周涌，李永进，宋春梅，等.葡萄籽原花青素对PC12细胞氧化损伤的神经保护作用及机制研究［J］.卫生研究，2009（4）：478－479.

［11］Li D，Wang X，Ren W，etal.High expression of liver histone deacetylase 3contributes to high－fat－diet－induced metabolic syndrome by suppressing the PPAR－gamma and LXR－alphapathways in E3rats［J］.Mol Cell Endocrinol，2011，344（1－2）：69－80.