大孔树脂柱层析法提取蛹虫草废弃培养基中的虫草素

曾 昱,陈作红

(湖南师范大学生命科学学院，中国 长沙 410081)

蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.) Link] 又名北冬虫夏草、北虫草，含有多种活性化合物，如虫草素、麦角固醇、甘露醇等，因其容易栽培已成为冬虫夏草的替代品[1-2]．虫草素(cordycepin)是蛹虫草的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、免疫调节等药理作用[3-4]．目前，虫草素主要从蛹虫草子实体中提取，从而导致虫草素的生产成本极高[5]．栽培过蛹虫草的固体培养基中含有丰富的菌丝体，其中含有大量的活性物质，但这些固体培养基常作为废料处理，造成很大的浪费[6-7]．

目前，大多数研究采用热水浸提法[8]、索氏提取法[9]、超临界萃取法[10]以及超声波水提法[11]等提取虫草素，但从这些方法得到的虫草素纯度不高，或者投入成本大，难以取得理想结果．刘红锦[12]等对大孔树脂分离纯化蛹虫草中虫草素的工艺进行了研究，考查了7种大孔吸附树脂对蛹虫草中虫草素吸附纯化的效果，再以高效液相色谱 (HPLC)法测定样液中虫草素含量，筛选出适宜的树脂．Ni He[13]等采用一种新的柱层析提取方法——循环柱层析提取法(CCE提取法)，对蛹虫草固体培养基中的虫草素进行提取，进一步分离纯化这些提取物，得到了纯度为98%以上的虫草素晶体．

本文以蛹虫草废弃固体培养基为原料，利用热水浸提法和大孔树脂柱层析法分离虫草素，再用聚酰胺树脂进行精制，并优化提取步骤，为后续的扩大试验和规模生产提供参考依据．

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

虫草素标样购自Sigma公司，蛹虫草废弃固体培养基由湖南益康生物高科技有限公司提供．

乙醇(分析级)；甲醇(色谱级)；超纯水；大孔树脂XAD16，XAD4，XAD7HP，XAD1180(北京慧德易科技有限公司)， DM130(青岛利航树脂材料有限公司)；聚酰胺树脂(浙江台州路桥四甲生化塑料厂)．

Waters 600高效液相色谱仪(Waters公司)；YWG C18(4.0 mm×300 mm，10 μm)色谱柱(大连依利特有限公司)．

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：YWGC18；流速：1 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：20 μL；柱温：25 ℃；流动相：15%甲醇；洗脱时间：20 min．所有的样品在进样之前须过0.45 μm滤膜．

1.2.2 标准曲线的制备 取虫草素母液(1 g/L)适量，将其分别配制成0.005，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5 g/L共6个梯度，在上述的色谱条件下进样20 μL，以进样量X(μg)与峰面积Y建立线性回归方程．

1.2.3 热水浸提粗提虫草素 采用热水浸提法对蛹虫草废弃固体培养基中的虫草素进行粗提．料液比(W/V)，浸提时间和浸提温度是影响虫草素提取的重要因素，本实验设计了一个3因素3水平的正交试验，如表1所示．

1.2.4 大孔树脂柱层析分离纯化虫草素 选用XAD4，XAD16，XAD7HP，XAD1180和DM130 共5种树脂进行静态吸附和解吸附实验，再对筛选出来的树脂进行动态吸附实验，确定最佳洗脱pH值和洗脱剂．

(1)大孔树脂的静态吸附和解吸附 取5 g已预处理的大孔树脂，置于锥形瓶中，分别加入pH3.0，6.0，9.0，12.0的培养基浸提液50 mL，静态吸附24 h，期间定时振荡．HPLC检测滤液中虫草素质量浓度．将上述处理的大孔树脂置于锥形瓶中，分别加入对应pH的40%乙醇30 mL，静态解吸附24 h，期间定时振荡．HPLC检测滤液中虫草素质量浓度．综合静态吸附和解吸附能力，筛选出最合适的大孔树脂．

(2)大孔树脂的动态吸附 取适量预处理后的大孔树脂装入层析柱中，调节pH为3.0，6.0，9.0，12.0，浸提液上样前调至相同的pH，用对应pH的蒸馏水洗脱，再用50 mL对应pH的30%，40%，50%，60%的乙醇溶液(均为体积分数，下同)洗脱，收集乙醇洗脱液，定容至50 mL，HPLC检测洗脱液中虫草素质量浓度，由此得到最佳的洗脱液浓度和洗脱pH值．

1.2.5 虫草素的分离 将预处理后的大孔树脂装入层析柱，调至最佳pH，浸提液上样前调至最佳pH．待吸附至层析柱2/3处时停止上样；用4～5倍柱床体积的蒸馏水洗脱，再用乙醇溶液洗脱，分级收集洗脱液．

活化GF254硅胶板，用虫草素标样与洗脱液点板，在展开剂为V氯仿∶V甲醇=2∶1(每10 mL加2滴氨水)的体系中展开，置于254 nm紫外灯下显色，合并含虫草素的洗脱液．

浓缩洗脱液，加入4倍体积的无水乙醇，充分反应后除去沉淀，浓缩置于4 ℃冰箱中数日，直至析出晶体．用蒸馏水重结晶多次，直至晶体变为纯白．

1.2.6 虫草素的精制 将预处理后的聚酰胺树脂装入层析柱，用蒸馏水溶解虫草素晶体，上样，用2～3倍柱床体积的蒸馏水洗脱，收集洗脱液，浓缩后置于冷冻干燥机内干燥，-20 ℃冰箱内保存．

2 结果与讨论

2.1 回归线性方程

虫草素的标准曲线为y=3 312 350.30x+243 414.61(R2=1.00)，线性范围为0.1～10 μg，在此范围内，线性关系良好．在选定的色谱条件下，虫草素的出峰时间为18 min左右．

2.2 优化的热水浸提条件

作者设计了一个3因素3水平正交实验优化热水浸提条件，结果如表1所示．

表1 正交试验结果

各因素不同试验水平对虫草素质量浓度的影响如表2所示.

表2 各因素不同试验水平对虫草素提取的影响

根据虫草素的质量浓度，作者选出了浸提实验的最佳条件组合，即浸提温度70 ℃，浸提时间8 h，料液比1 g∶20 mL．

2.3 虫草素的分离

根据5种大孔树脂对虫草素的吸附和解吸附能力对其进行了筛选，结果如图1及图2所示，可以看出, XAD16吸附后滤液中虫草素质量浓度最低, 解吸附后滤液中虫草素质量浓度最高,因此XAD16对虫草素静态吸附能力和解吸附能力最好．不同pH条件下各树脂的吸附和解吸附效果不同, 对于XAD16, pH为9和12时效果最好．

图1 大孔树脂对虫草素的吸附能力Fig.1 Adsorption of cordycepin on different macroporous resins

图2 大孔树脂对虫草素的解吸附能力Fig.2 Desorption of cordycepin on different macroporous resins

应用XAD16进行动态洗脱时，不同浓度的乙醇在不同pH下的洗脱效果如图3．可以看出，当乙醇体积分数为50%和60%，pH为9.0和12.0时，洗脱效果最明显．

综合以上的结果，作者最终选择XAD16树脂作为填料，50%乙醇作为洗脱剂，pH为9.0的柱层析体系对虫草素进行分离．

2.4 虫草素晶体的HPLC检测

按照优化的实验条件对虫草素进行提取和纯化，得到了纯白色晶体产物．HPLC检测虫草素水溶液，纯度达到了98%以上，见图4．

图3 XAD16动态实验Fig.3 Elution of cordycepin by XAD16 macroporous resin

图4 晶体的HPLC分析Fig.4 HPLC analysis of cordycepin crystal

3 结论

本实验以废弃的蛹虫草固体培养基为提取材料，利用优化的热水浸提法，即料液比为1 g∶20 mL，温度70 ℃，浸提时间8 h，对虫草素进行粗提；然后在填料为XAD16树脂，pH9.0，洗脱剂为50%乙醇的层析柱体系中对其分离；再通过浓缩、结晶等步骤，得到了白色晶体；最后通过聚酰胺树脂精制，除去晶体中的残余色素后，得到的虫草素纯度达到了98%以上．本实验操作简单，不需要复杂的仪器设备．下一步将进行扩大实验，较大规模地从废弃的蛹虫草固体培养基中提取虫草素，并进一步确定提取和纯化工艺参数．

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