银杏叶提取物对氧化应激损伤黑素细胞的影响＊

肖 茜 王 超 易秀莉 陈佳希 李春英 高天文

第四军医大学西京皮肤医院（西安710032）

△ 第四军医大学西京医院药剂科（西安710032）

银杏又名公孙树，白果树，是我国分布最为广泛的树种之一，其入药始载于元代吴瑞著的《日用本草》。它可以补气养血，健脾益肾。自上世纪60年代起，国内外学者先后开始研究银杏叶提取物（Extract of Ginkgo bilobaleaves，EGb761），发现它具有较强的抗氧化作用，可以防治氧化应激引起的多种心脑血管疾病［1，2］。本研究拟采用银杏叶提取物作用于黑素细胞氧化应激损伤，以观察其对氧化应激损伤黑素细胞的保护作用。从而为黑素细胞相关疾病的药物防治提供实验依据。

1 材料与方法1.1 材 料 正常人表皮黑素细胞系PIG1细胞（美国Loyola大学Caroline Le Poole博士赠送），254培养基及人黑素细胞生长添加剂（美国Cascade Biologics/Invitrogen公司），胎牛血清（美国GIBCO公司），EGb761（德国Schwabe公司专利/台湾济生公司），0.25%胰蛋白酶－EDTA消化液（北京索莱宝科技有限公司），CCK－8（江苏碧云天生物技术研究所），倒置显微镜（日本Nikon公司），酶联免疫分析仪（美国Bio－Rad公司）。

1.2 方 法 实验前将人黑素细胞生长添加剂以1：100的体积比加入到254培养基中。将PIG1细胞置于含5%的胎牛血清，100U/mL的青霉素及100mg/mL链霉素的254培养基中，于37℃的CO2孵育箱内培养。实验开始时将1.0mmol/L H2O2加入PIG1细胞中，分别于H2O2处理3小时和24小时后加入100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的 EGb761建立EGb761低、中、高剂量组。A：空白对照组：正常人黑素细胞系PIG1细胞；B：H2O2处理3h组；C：H2O2处理24h组；A1、A2、A3：于正常组中分别加入100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的EGb761；B1、B2、B3：于 H2O2加入3h后分别加入100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL的EGb761；C1、C2、C3：于 H2O2加入24h后分别加入 100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL 的EGb761。用CCK8法检测黑素细胞的细胞活力变化，同时用倒置显微镜观察黑素细胞形态学的改变。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行分析。数据以均数±标准差（±s）表示。两组数据比较分析，符合正态分布的数据采用单因素方差分析方法，方差不齐时选用Satterthwaite方法进行校正的t检验，不符合正态分布的数据采用Wilcoxon秩和检验。实验结果以P≤0.05为差异有显著性统计学意义。

2 实验结果2.1 银杏叶提取物EGb761对黑素细胞氧化应激损伤细胞活力的影响 通过培养人黑素细胞系PIG1细胞，采用CCK8法检测EGb761对不同处理组黑素细胞活力的影响。我们加入1.0mmol/l H2O2于黑素细胞中，分别处理0h、3h、24h后加入低、中、高剂量的EGb761，发现EGb761可以剂量依赖地提高黑素细胞的存活率，表明EGb761对黑素细胞氧化应激损伤具有保护作用（见图1）。A1、A2、A3与A组比较均P＞0.05；B1、B2、B3与B组比较均P≤0.05；C1、C2、C3与C组比较均P≤0.05。

图1 CCK8法检测EGb761对黑素细胞氧化应激损伤细胞活力的影响

2.2 银杏叶提取物EGb761对黑素细胞形态学的影响通过培养人黑素细胞系PIG1细胞，观察了不同浓度EGb761对H2O2处理0h、3h、24h后黑素细胞形态学的变化。倒置显微镜下观察可见H2O2组细胞树突明显收缩，部分细胞变圆，不同浓度EGb761可以明显抑制细胞树突收缩，并显示一定的剂量依赖性（见图2）。

图2 不同浓度的EGb761对黑素细胞氧化应激损伤形态学的影响

3 讨 论银杏叶提取物是一种广泛应用的天然药物。目前国际上公认的标准银杏叶提取物是按德国Schwabe专利工艺生产的EGb761，它是从银杏叶中经多个步骤分离、纯化而提取出的一种标准化的银杏叶提取物制剂，其中包含24%银杏黄酮苷类和6%银杏萜内酯类成分［3］。上世纪六十年代，国内外学者先后开始研究EGb761，发现其对多种氧化应激引起的心、脑血管疾病均有较好的预防和治疗效果，EGb761可以激活脑组织及细胞代谢，改善脑血液循环，并具有抗氧化活性，是一种有效的自由基清除剂［1，2］。近20年来，银杏叶提取物制剂已成为国际上防治心脑血管疾病首选的天然药物，也是欧美市场上连年高居榜首的天然药物。李爽乐等［4］研究发现，EGb761可以减轻H2O2诱导的晶状体上皮细胞氧化应激损伤；牟宽厚等［5］研究发现，浮萍紫丹参对体外培养的黑素细胞生长具有促进作用。我们前期实验研究表明［6］，EGb761可以减轻β淀粉样蛋白所致的海马神经元氧化应激损伤，改善神经再生微环境，促进神经细胞生长，从而对神经细胞发挥着重要的抗氧化作用。既然黑素细胞与海马神经元同起源于神经细胞，那么，EGb761能否对抗黑素细胞氧化应激损伤呢？国外有学者［7］在临床上应用EGb761治疗白癜风获得了一定的临床疗效，但EGb761治疗白癜风的具体作用机制尚不清楚，目前国内外在EGb761对黑素细胞氧化应激损伤的生物学功能研究方面尚未见报道。我们通过以上研究，发现EGb761可以剂量依赖地提高黑素细胞的存活率，且不同浓度EGb761可以明显抑制细胞树突收缩，显示了一定的剂量依赖性，实验结果表明EGb761可以对抗黑素细胞氧化应激损伤，初步确定了银杏叶提取物对白癜风黑素细胞氧化应激损伤具有保护作用，可以防治氧化应激引起的黑素细胞相关疾病，从而为黑素相关疾病的药物防治提供新的思路，以促进天然药物的研究、开发和利用。

［1］Yao Z，Drieu K，PapadopoulosV.The Ginkgo biloba extract EGb761rescues the PC12neuronal cells from betaamyloid－induced cell death by inhibiting the formation of betaamyloid derved diffusible neurotoxic ligands ［J］.Brain Res，2001，889（1－2）：181－190.

［2］Le Bars PL，Velasco FM，Ferguson JM，Dessain EC，Kieser M，Hoerr R.Influence of the severity of cognitive impairment on the effect of the Ginkgo biloba extract EGb761in Alzheimer’s disease［J］.Neuropsychobiology，2002，45（1）：19－26.

［3］邹 健，蒋晓燕，徐晓明.银杏叶提取物EGb761神经保护作用研究进展 ［J］.中草药，2005，36（11）：1734－1736.

［4］李爽乐，罗清礼，李正时，等.银杏叶提取物对H2O2诱导的晶状体上皮细胞Bcl－2和Bax表达的影响 ［J］.国际眼科杂志，2006，6（4）：787－789.

［5］牟宽厚，张宪旗 陆庭斌，等.浮萍紫丹参对体外培养的黑素细胞生长的影响［J］.陕西中医，2003，24（12）：1136－1137.

［6］Qian Xiao，Chao Wang，Junchang Li，Qian Hou，Jinghua Li，Jing Ma，Wen Wang，Zongren Wang.Ginkgolide B protects hippocampal neurons from apoptosis induced by betaamyloid 25－35partly via up－regulation of brain－derived neurotrophic factor［J］.European Journal of Pharmacology.2010，12（647）：48－54.

［7］Szczurko O，Shear N，Taddio A，Boon H.Ginkgo biloba for the treatment of vitilgo vulgaris：an open label pilot clinical trial［J］.BMC Complementary and Alternative Medicine.2011，11（21）：1472－1481.