活血通经消瘀巴布剂组方药物木芙蓉叶等乙醇提取工艺研究

2013-11-21杨一丁杨文婷高文勇

世界中医药 2013年4期

杨一丁张伟杨文婷高文勇

(1青岛市市立医院，青岛，266071;2青岛市海慈医疗集团，青岛，266033;3山东中医药大学药学院，济南，250355;4青岛四方嘉兴路街道人民路社区卫生服务站，青岛，266033)

我们在本实验以醇浸物和大黄素为指标，对活血通经消瘀巴布剂组方药物中的木芙蓉、紫草和大黄进行乙醇提取工艺正交设计优化实验研究，考察乙醇浓度，乙醇用量(倍)，提取时间(h)，提取次数等因素，确定最佳工艺条件。

1 仪器、试剂与药材

1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪二元泵DAD检测器(美国);JA2003型电子分析天平(上海);超声波清洗器:KQ100型(昆山市超声波仪器厂)工作频率40 kHz，输出超声电功率100 W;BuchiR215V型旋转蒸发仪(瑞士)。

1.2 试剂大黄素对照品(中国药品生物制品检定所，批号:0756－00110);甲醇为色谱纯(美国天地试剂公司)，乙醇为药用，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

1.3 药材药材购自安徽亳州，经青岛市药检所吴爱英主任中药师鉴定，木芙蓉叶为锦葵科植物木芙蓉Hibiscus mutabilis L.的叶，大黄为Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎，紫草为紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma(Royle)Johnst的干燥根。

2 实验方法

2.1 醇浸物测定方法量取醇提液10 mL，精密称重，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称重。计算醇浸物含量［(g/g)×%］。

2.2 大黄素含量测定方法［1］

2.2.1 色谱条件色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6 mm × 250 mm，5 μm，Lichrospher，汉邦科技)，流动相为甲醇－0.1%磷酸溶液(85∶15)，流速1.0 mL/min;检测波长为254 nm。理论塔板数按大黄素峰计算应不低于1500。

2.2.2 标准曲线的绘制精密称取大黄素对照品1.408 2 mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制得浓度为5.638 2 μg/mL的大黄素对照品溶液。分别精密吸取大黄素对照品溶液 1.0、2.0、4.0、6.0、10.0、15.0μL，按2.1.1色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标、大黄素量为横坐标，结果在选定的色谱条件下，大黄素含量在0.005 6～0.084 μg的范围内均呈现良好的线性关系;回归方程为y=361658x－368，r=0.999 5。

2.3 正交方案设计以醇浸膏和大黄素提取率为指标，以乙醇浓度，乙醇用量(倍)，提取时间(h)，提取次数为因素，进行L9(34)的正交试验。正交因素和水平见表1。

表1 L9(34)正交试验因素和水平表

2.4 乙醇提取实验将木芙蓉叶、紫草和大黄等3味药药材细粉(过40目筛)，按处方比例量分别称取9份，每份100 g，分别按L9(34)表中给出的条件进行提取，提取时间从沸腾开始时记录。提取结束后，分别合并提取液，旋转蒸发回收乙醇至适量，再以无水乙醇定容至100.00 mL，得1－9号样品液。

3 正交试验结果

1)分别精密量取“2.4乙醇提取实验”制得的1－9号样品溶液各10 mL，按“2.1醇浸物测定方法”分别测定并计算1－9号样品醇浸物含量(mg/g)。每个样品重复测定3次，计算3次平均值。结果见表2。2)将1)步制得的其中1份1－9号醇浸物分别加8%的盐酸10.00 mL溶解，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加热回流1h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，减压回收三氯甲烷至干，残渣用甲醇溶解、转移并定容至10 mL，摇匀，滤过。取续滤液，按“2.2大黄素含量测定方法”分别进样、测定，计算1－9号样品大黄素含量(mg/g%)。每个样品重复测定3次，计算3次平均值。结果见表2。

表2 正交试验表及结果(n=3)

表3 醇浸物方差数据分析(n=3)

4 结果分析

以醇浸物提取率为指标，影响因素从大到小依次为D＞A＞C＞B;其中A因素和D因素有统计学意义(P＜0.05)，B因素和C因素无显著影响;最佳条件为A2B1C1D3。以大黄素提取率为指标，影响因素从大到小依次为D＞A＞C＞B，其中A因素和D因素有非常显著影响(P＜0.01)，C因素有显著影响(P＜0.05)，B因素无显著影响;最佳条件为A2B2C1D3。综合醇浸物和大黄素提取率，考虑到B因素对这两种指标成分提取率均无显著影响，选择A2B1C1D3方案进行工艺验证实验，结果该方案两种指标成分提取率分别醇浸物为 2.4208［(g/g)×%］，大黄素为 241.22［(mg/g×%］。因此确定A2B1C1D3为最终生产工艺条件，即用浓度为60%的乙醇，提取3次，每次乙醇用量为药材重量的6倍，每次提取时间为40min。

表4 大黄素方差数据分析(n=3)

5 工艺说明

5.1 关于提取方案该巴布剂组方药物中的木芙蓉、紫草和大黄，及提取挥发油后的乳香、没药、三棱、莪术等药药渣均含有醇溶性成分。木芙蓉主要化学成分为黄酮苷、酚类、氨基酸、鞣质、还原糖、甾类化合物和挥发油类成分，其中黄酮苷是其主要活性成分［2－3］，具有抗炎镇痛等药理作用［4］。姚莉韵［5］实验研究认为乙醇回流提取总黄酮效果大大高于水煎法、温浸法，回流提取的最佳工艺条件是用12倍量70%乙醇提取3次，每次3h，其中乙醇浓度是影响提取率的主要因素。大黄主要含蒽醌类化合物，总量为1.01% ～5.19%［6］。蒋孟良等［7］比较几种提取方法对总蒽醌提取影响，结果认为醇提＞渗漉＞水提，热提强于冷提。朱雪瑜等［8］研究认为60% ～80%乙醇浓度对大黄总蒽醌(游离蒽醌和结合蒽醌)有较好的提取效果，最佳工艺为用70%的乙醇提取3次，每次1 h，溶剂量为药材的10、8、8倍。紫草主要生物活性成分为萘醌类等多种化合物［9－10］，乙醇浓度对萘醌收率有显著影响［11］。因此，实验设计以乙醇为溶媒进行正交设计优化实验，确定最佳工艺条件。

图1 高效液相色谱图

5.2 关于大黄素含量测定方法参考含大黄复方制剂大黄素含量测定的有关报道资料，先后对流动相甲醇－0.1% 磷酸(80∶20)［12－13］、甲醇－ 0.1% 磷酸(85∶15)［14］、甲醇－ 0.2% 磷酸(84∶16)［15］、甲醇－ 0.2%磷酸(70∶30)［16］、乙腈－甲醇－ 1% 磷酸(35∶37∶28)［17］、甲醇－水－冰醋酸(72∶28∶1.0)［18］等系统进行了预试验，观察系统分离效果。结果表明，用甲醇－0.1%磷酸溶液(85∶15)作为流动相测定样品中大黄素含量较为适宜，出峰时间短，阴性对照品无干扰(见图1)。确定大黄素含量测定的色谱条件。

5.3 关于精密度和重复性对照品溶液连续进样5次大黄素峰面积的RSD为1.48%，2号乙醇提取液按“3.2”步处理后依次进样5次大黄素峰面积积分值的RSD值为1.19%，表明该色谱条件的精密度和重复性良好。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典一部［S］.2010版.北京:中国医药科技出版社，2010:22.

［2］姚莉韵，陆阳，陈泽乃.木芙蓉叶化学成分研究［J］.中草药，2003，34(3):201－203.

［3］张丽，周长征.木芙蓉叶的研究进展［J］.中国医药指南，2013，11(1):453－454.

［4］邬科，卢立琼.木芙蓉叶的药理研究进展［J］.海峡药学，2010，22(3):37－38.

［5］姚莉韵，王国艳，王丽平.木芙蓉叶提取工艺的研究［J］.中成药，2000，22(12):827 －829.

［6］王本祥.现代中药药理学［M］.天津:天津科学技术出版社，1999:1368).

［7］蒋孟良，郭建生，杨平华.提取方法对大黄中总蒽醌含量的影响［J］.现代应用药学，1993，10(1):33.

［8］朱雪瑜，郭鹏，张铁军.正交设计优选复方大黄颗粒中大黄蒽醌的提取工艺［J］.第二军医大学学报，2010，31(5):574 －575.

［9］徐新刚，王宝珍，孙志蓉，等.新疆紫草的主要化学成分［J］.吉林大学学报:理学版，2010，48(2):319 －322.

［10］孙相民.紫草的药理活性与临床应用研究进展［J］.中国实用医药，2010，5(16):251 －252.

［11］冯文文，李国玉，谭勇，等.新疆紫草中萘醌类成分的提取工艺研究［J］.石河子大学学报:自然科学版.2011;29(1):68 －70.