褪黑素对大鼠急性脊髓损伤后不同时期IL-10表达的影响

徐玉生，李星晨，金伟林，马玉斐，曾冠楠，王培松

郑州大学第一附属医院骨科 郑州 450052

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后大量的炎性细胞浸润和大量炎症细胞因子的产生是导致脊髓渐进性溃变的主要因素[1]。有学者[2]报道，SCI后多种细胞因子明显上调，其参与并调节损伤诱导的炎症反应在继发性损伤的病理过程中起着重要作用。研究[2-4]发现白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)可对SCI脊髓组织中NF-κB表达和巨噬细胞浸润产生影响，从而减轻炎症反应。实验[3]证实褪黑素对多种器官损伤后的炎症反应有抑制作用，但对SCI后神经细胞周围炎症反应及修复的作用尚不明确，特别是对细胞因子IL-10的分泌作用至今未阐明。作者通过观察SCI后一次性注射人褪黑素制剂，观察脊髓和血液中IL-10的变化，探索褪黑素诱导内源性IL-10的表达对SCI的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF级健康成年雄性SD大鼠108只，体质量(220±20)g，购自河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2010-0002。在通风、适宜温度和湿度的动物室内常规饲养1周。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。

1.2主要试剂及仪器Trizol试剂、RT试剂盒(编号：AE101-01)和PCR试剂盒(编号：AP111-12)均购自Transgene公司，引物购自北京博大泰克公司，大鼠IL-10 ELISA试剂盒购自美国RD公司，兔抗鼠IL-10抗体、DAB试剂盒和SP9002免疫组化试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，褪黑素、DEPC和EB购自美国Sigma公司。PCR GeneAmp System(美国Applied Biosystems公司，型号：2700)，低温离心机(美国Sigma公司，型号：3K30)，图像记录分析系统(大连Jim-X Scientific，型号：D-140)，LE ICACM 1900恒冷箱切片机。

1.3动物模型的建立以体积分数10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉。大鼠取俯卧位，固定于操作台上。术区备皮，常规消毒铺巾，取后正中切口，以T12为中心显露T11～13棘突和椎板，咬除T12节段椎板，暴露脊髓硬膜。硬膜上方放置一圆形塑料垫片(直径6 mm)，再采用改良的Allen’s WD法，用预实验中确定的致伤质量(5 g)的砝码自距硬膜15 cm的高度沿导管垂直落下，造成大鼠SCI模型。造模成功的标准：打击后鼠尾出现无规则的痉挛性摆动、双下肢呈回缩性扑动，硬膜表面充血水肿。术毕以生理盐水冲洗术野，再次消毒后常规缝合切口。

1.4动物的分组及干预采用随机数字表法将108只大鼠分为SCI组(A组)、褪黑素治疗组(B组)和假手术组(C组)。A、B 2组按1.3的方法造模，10 min后分别按体质量腹腔注射等体积的含体积分数5%乙醇的生理盐水和褪黑素(100 mg/kg)，对照组仅行椎板切除术而不损伤脊髓。各组大鼠每日均给予青霉素40万U腹腔注射预防感染，A、B 2组术后给予人工辅助排尿、排便4～5次/d。

1.5BBB运动功能评分分别于术后第1、2、3、5、7天将大鼠置于评分操作台上，环境适应后由3位熟悉评分标准但不知分组者独立观察4 min，取平均值作为评分结果。每时间点每组均随机选取6只大鼠，评分后处死，取血清和脊髓组织备用。

1.6组织固定、取材及切片制备于术后第3天时每组中随机选取6只大鼠，腹腔注射麻醉后行升主动脉灌注(37 ℃的生理盐水400 mL充分冲洗组织内血液)，并以4 ℃ 40 g/L的多聚甲醛进行固定，30 min后取出手术部位脊髓标本，放置于40 g/L的多聚甲醛中室温保存。用LE ICACM 1900恒冷箱切片机对脊髓组织作横切面切片(6 μm厚)，载玻片收集组织后，恒温烘箱烘干进行HE染色及免疫组化SP法染色。

1.7血清中IL-10水平检测采用双抗体夹心ELISA法检测血清中IL-10的含量。每例样本取10 μL血清加入每个孔内，按试剂盒流程说明进行操作，最终于450 nm波长下测定吸光度(A)，根据标准曲线计算样品中IL-10的含量。

1.8脊髓中IL-10mRNA表达的RT-PCR检测

称取100 mg冻存的脊髓组织，提取总RNA。大鼠IL-10上游引物序列5’-CAGTCAGCCAGACCCACAT-3’，下游引物序列5’-GGCAACCCAAGTAACCCT-3’，扩增产物大小为141 bp 。内参GAPDH上游引物序列5’-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3’，下游引物序列5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’，扩增产物大小为595 bp。反应体系RT-PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环；72 ℃延伸6 min。取5 μL扩增产物进行电泳，在紫外线投射仪下观察电泳条带，记录图像后用D-140图像记录分析系统进行分析，以目的基因和内参条带的灰度值的比值表示目的基因的相对表达量。

1.9组织学观察及IL-10蛋白表达的检测HE染色观察脊髓病理改变；免疫组化按 SP9002试剂盒说明书操作，中性树脂封片。每个标本取同序数切片6张，兔抗鼠IL-10抗体(按200倍稀释)为一抗。以PBS代替一抗作为阴性对照，细胞核和(或)胞质染成黄褐色或黑色为阳性细胞。每张片计数高表达区3个高倍镜视野中的阳性细胞个数，最后取算术平均数代表该标本IL-10蛋白的表达水平。

1.10统计学处理采用SPSS 17.0进行分析。应用单因素方差分析和LSD-t检验比较3组大鼠BBB评分、血清中IL-10水平和脊髓组织中IL-10 mRNA及蛋白表达水平的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组大鼠的一般情况共108只大鼠，操作过程中A组3只、B组1只因麻醉过深后死亡，A组4只、B组2只造模不成功后踢出实验，后进行同情况下补充。术后早期：A 、B 2组大鼠活动及进食明显减少，C组较术前未有明显改变；A、B 2组均出现后肢瘫痪，尿潴留情况。术后晚期：B、C 2组较A组大鼠活动及进食较好。取脊髓标本见A组损伤部位出现溃疡及大量的无菌性炎症反应；B组炎症反应较轻，未见溃疡面。

2.2术后各组各个时间点BBB运动功能评分比较

见表1。

表1 术后各组各个时间点BBB运动功能评分比较 (n=6)

*与C组比较，P<0.01;#与A组比较，P<0.01。

2.3术后各组各个时间点血清中IL-10含量比较见表2。血清中IL-10水平从高到低依次为B组、A组、C组，且各组间差异有统计学意义(P<0.001)，且A、B组术后第5天达到高峰。

*与C组比较，P<0.01;#与A组比较，P<0.01。

2.4术后各组各个时间点脊髓中IL-10mRNA表达水平比较见表3。脊髓中IL-10 mRNA表达水平各个时间点从高到低依次为B组、A组、C组，且各组间差异有统计学意义(P<0.001)，A、B 2组术后在第5天达到高峰。

2.5脊髓标本HE染色和免疫组化染色结果见图1。A、B 2组出现脊髓组织血管充血，B组较A组神经细胞脱水变化轻，说明褪黑素可以减轻脊髓损伤后病理变化。免疫组化见IL-10在中央管附近的神经细胞及神经胶质细胞胞质中分布较多，其中中央管室管膜细胞胞质中也有较强表达。阳性细胞计数从多到少依次为B组[(10.6±1.8) 个/HP]、A组[(9.1±1.4) 个/HP]和C组[(4.1±0.5) 个/HP]，差异有统计学意义(F=146.281,P<0.001)。各组两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)。

表3 术后各组各个时间点脊髓中IL-10 mRNA表达水平比较 (n=6)

*与C组比较，P<0.01;#与A组比较，P<0.01。

图1 各组大鼠脊髓HE染色和免疫组化染色结果

3 讨论

急性脊髓损伤后脊髓组织主要有缺血、脂质过氧化、离子的失衡、炎症细胞浸润和炎症因子的释放等表现。其中炎症因子的大量产生和释放是继发性损伤的主要过程。有效地控制SCI后的炎症反应，尽可能地使继发性损伤的程度降到最低，是改善预后的关键所在。

褪黑素是一类主要有松果体细胞分泌的肽类激素，具有调节时间节律、影响神经内分泌、调节体温中枢等生理作用，并可减轻中性粒细胞介导的毒性损害作用[5]。研究证实其对脊髓的保护作用主要是通过提高神经营养作用[4，6]、减轻炎症反应[7]、减少细胞凋亡[8]来实现的。作者的前期实验[6]已经证实100 mg/kg的褪黑素具有提高神经生长因子表达、抑制脂质过氧化反应作用。该实验结果显示SCI后100 mg/kg的褪黑素对大鼠食欲和精神状态的改善较为明显，可能与其有维持生物正常的昼夜节律、抗疲劳、焦虑、抑郁[9]和镇痛[10]的作用有关。实验中观察到在SCI晚期B组相对于A组未出现严重的无菌性炎症反应和溃疡面，说明褪黑素对损伤后的脊髓保护作用是显著的。

IL-10是一种可以抑制Th1细胞合成细胞因子的因子，被称为细胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF)[11]，SCI后其会反应性的显著增高[7]。Jackson等[12]研究证实IL-10能够抑制早期炎症反应，特别是对SCI后细胞中的NF-κB转录因子的抑制作用。局部胶质细胞、小胶质细胞、中央管周围内皮细胞和神经细胞在SCI后激活NF-κB[13]，通过自分泌和旁分泌途径产生TNF、IL-1、IL-6和IL-8等因子，严重影响组织器官的修复[14]。这些细胞也产生抗炎性细胞因子IL-10[15]，并对NF-κB表达有明显的抑制作用[16]，从而也抑制单核巨噬细胞等炎性细胞的浸润[11-13]。打破这种平衡并增加抗炎因子分泌成为治疗的首要途径。该实验结果显示血清中IL-10的表达量和脊髓中IL-10 mRNA的水平在各个时间点均有B组高于A、C 2组，并且在损伤后第5天出现高峰的现象，证明100 mg/kg的褪黑素能够影响IL-10的表达，且能够明显提高高峰期的表达水平。免疫组化结果也证实了IL-10蛋白表达的部位及细胞主要集中在中央管周围的室管膜细胞胞质及神经细胞和胶质细胞胞质中。

总之，作者的研究结果可以直接和间接证明褪黑素能通过IL-10起到抗炎与脊髓神经修复的作用。褪黑素对SCI大鼠体内IL-10水平的作用是课题组研究的一个开端，作者对褪黑素的理解仍处在初级阶段，其对SCI后的修复作用不仅仅是在一个炎症因子方面。今后作者还将研究褪黑素对其他的炎症因子的表达是否有类似的促进作用等。褪黑素有可能成为继甲强龙后的一个治疗急性SCI的有效药物[17-18]，因此认为褪黑素的应用前景非常广阔。

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