重组人粒细胞集落刺激因子对急性缺血再灌注脑损伤大鼠脑组织Egr-1、Survivin蛋白表达及血管再生的影响

程鹤云，滕军放，郭利利

郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450001

缺血性脑血管病发生后，尽快恢复缺血半暗带血供对于减少神经元凋亡，促进神经功能修复有着重要意义。缺血后血管再生的情况与脑血管病的进展、转归关系密切。早期生长因子1(early growth response-1，Egr-1)可以调控VEGF的转录，从而促进血管重建。研究[1-2]发现抗凋亡因子Survivin强烈表达于血管平滑肌细胞、体外立体管腔内皮细胞和体内新生毛细血管内皮细胞，提示其在新生血管形成的过程中发挥着重要的作用。重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony simulating factor,rhG-CSF)是一类骨髓干细胞动员剂，可上调细胞因子的表达，特别是胶质细胞有大量G-CSF受体存在。该实验应用rhG-CSF干预大脑中动脉闭塞(MCAO)模型大鼠，观察其对大鼠脑组织Egr-1、Survivin蛋白表达及血管再生的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂rhG-CSF(山东齐鲁制药有限公司)，MCAO模型专用尼龙线栓购于北京沙东生物制品公司，Egr-1、Survivin兔抗鼠多克隆抗体均购于北京博奥森生物有限公司，CD31鼠单克隆抗体购自美国 Santa Cruz公司，SP9000与DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2实验动物及分组健康清洁级雄性SD大鼠72只(河南省实验动物中心提供)，体质量280～320 g。随机分为假手术组，模型组和治疗组，每组24只。模型组和治疗组制作大鼠MCAO模型。治疗组大鼠手术2 h后腹部皮下注射rhG-CSF 50 μg/(kg·d)，单次注射7.5 mL，连续用药5 d；模型组和假手术组给予等体积生理盐水，连续用药5 d。各组分别于术后7、14和21 d处死 8只大鼠。

1.3MCAO模型制备麻醉大鼠，仰卧固定，颈部剪毛备皮，暴露、分离右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，模型组和治疗组结扎颈外动脉及颈总动脉近心端，于颈总动脉入路插入线栓18～20 mm，有阻力感时(约至大脑中动脉起始部分叉处)，栓塞一侧大脑中动脉供血区。假手术组不插线直接缝合。90 min后缓慢将线栓拔出，退至颈外动脉残端，造模完成。大鼠清醒后以神经行为学改变为依据，参考Zea Longa 评分法行单盲评分，筛选出神经功能评分为1、2、3 分的大鼠。

1.4Egr-1、Survivin和CD31蛋白表达的检测备用各组大鼠以300 mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧固定，开胸，经心尖至升主动脉入路，依次用生理盐水、40 g/L甲醛溶液各200 mL灌注，然后断头完整取脑，置于甲醛溶液后固定2 h，蒸馏水浸泡4 h。常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。于缺血半暗带部位开始连续冠状位切片，厚度7 μm，贴于多聚赖氨酸处理的载玻片上，4 ℃保存。取切片常规脱蜡水化，经蒸馏水冲洗后，按SP9000免疫组化试剂盒提供的实验步骤操作，DAB 显色，光镜下观察，胞质出现棕色颗粒为阳性着色细胞。高倍镜(×400)下在缺血半暗带区随机取5个视野，采用德国Lecia显微照像系统行图像采集，并应用生物数字图像采集系统进行图像分析(上海山富科学仪器有限公司，Biosens Digital Imaging System v1.6)，检测各个视野平均灰度值，然后减去此片背景平均灰度值，取其相反数作为最终光密度(D)值。

1.5统计学处理采用SPSS 17.0分析，各组大鼠脑组织Egr-1、Survivin和毛细血管密度的比较用单因素方差分析及LSD-t检验，检验水准α= 0.05。

2 结果

2.1各组大鼠脑组织缺血半暗带Egr-1和Survivin蛋白的表达见表1和图1、2。

表1 各组大鼠脑组织缺血半暗带Egr-1和Survivin蛋白的表达

*与假手术组比较，P<0.05；#与模型组比较，P<0.05。

2.2各组大鼠脑组织毛细血管假手术组可见稀疏毛细血管(图3A)，模型组可见星形胶质细胞浸润及较多新生毛细血管(图3B)，治疗组视野下新生毛细血管最多(图3C)。实验14 d，假手术组、模型组和治疗组大鼠脑组织毛细血管密度分别为每个高倍镜视野(1.5±1.7)、(9.1±3.0)和(14.2±2.9)个(F=139.712，P<0.001)。模型组和治疗组高于假手术组，治疗组高于模型组。

图2 各组大鼠脑组织Survivin蛋白的表达(SP，×400)

图3 14 d各组大鼠毛细血管密度(SP，×400)

3 讨论

MCAO模型大鼠的脑组织中存在模拟动脉粥样硬化型脑梗死相似的缺血坏死区及缺血边缘区，即缺血半暗带。以rhG-CSF诱导血管再生的可能机制包括直接活化脑血管内皮细胞、动员骨髓内皮祖细胞进入脑缺血区以及诱导其他促血管再生因子，已知的作用机制还包括eNOS等表达上调，调控 VEGF通路，促进循环中的干细胞在缺血刺激的情况下迁移，尤其是造血干细胞迁移至受损部位。Zhao等[2]发现rhG-CSF对促进心肌梗死兔的受损部位微血管再生，促进受损组织的重塑和功能重建有重要作用。

Egr-1是由定位于人染色体5q23-31的Egr-1基因转录产生的由533个氨基酸构成的转录因子。在神经元损伤的修复、血管因子的表达、生长因子基因表达的调控及癌基因表达的调控中发挥重要作用。Egr-1的转录依赖Ras-Raf-MEK-ERK1/2信号转导通路。Egr-1可以通过与VEGF启动子区富含鸟嘌呤序列[3]结合，调控VEGF的转录。王鹏等[4]通过脑胶质瘤SHG44细胞的研究初步证明了Egr-1可介导Survivin促进血管形成。

Survivin蛋白是一类存在于哺乳动物细胞中的一类凋亡抑制蛋白家族中最晚发现的成员。由位于人17号染色体顶端Survivin基因转录而成的142个氨基酸组成的相对分子质量约为16 200的蛋白质。有研究表明缺血再灌注损伤的脑组织中各种血管发生细胞因子都可通过调节Survivin的表达来调节正常血管内皮细胞的凋亡或存活。破坏Survivin的表达能够取消上述细胞因子的促血管发生作用[5-6]。

作者的研究发现，模型组Survivin及Egr-1蛋白的表达均较假手术组升高，可能与重建缺血半暗带毛细血管，促进组织功能恢复有关，而rhG-CSF治疗7和14 dSurvivin和Egr-1蛋白的表达均较模型组及假手术组上升更为明显。实验14 d后，治疗组大鼠脑组织毛细血管密度高于其他2组。通过以上分析不难看出，rhG-CSF可提高Egr-1及Survivin蛋白的表达，并刺激毛细血管再生。

综上所述，rhG-CSF可明显增加MCAO大鼠脑组织Egr-1及Survivin蛋白的表达，并可促进缺血半暗带微血管的再生，但其具体分子作用机制及远期存活率及神经功能改善情况仍需进一步研究探讨。

[1] Simosa HF，Wang G，Sui X，et al.Survivin expression is up-regulated in vascular injury and identifies a distinct cellular phenotype[J].J Vasc Surg，2005，41(4)：682

[2] Zhao Q，Sun C，Xu X，et al.Early use of granulocyte colony stimulating factor improves survival in a rabbit model of chronic myocardial ischemia[J].J Cardiol，2013，61(1)：87

[3] O’ Connor DS,Schechner JS,Adida C,et al.Control of apoptosis during angiogenesis by survivin expression in endothelial Cells[J].Am J Pathol， 2000,156(2):393

[4] 王鹏.Egr-1介导胶质瘤细胞内Survivin促进血管形成实验研究[D].第四军医大学，2010.

[5] AbouAlaiwi WA, Ratnam S,Booth RL， et al. Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation[J]. Hum Mol Genet，2011，20(2): 354

[6] Zhu L，Fukuda S，Cordis G,et al.Anti-apoptotic protein surviving plays a significant role in tubular morphogenesis of human coronary arteriolar endothelial cells by hypoxic preconditioning[J].FEBS Lett,2001，508(3)：369