肺癌患者外周血基因组DNA端粒长度的变化及意义*

魏小玲,谭善娟,吴拥军#

1)郑州大学公共卫生学院毒理学教研室 郑州 450001 2)青岛市市立医院医院感染管理科 青岛 266071

肺癌是一种严重威胁人类健康和生命的恶性肿瘤[1-3]。肺癌的预后取决于早期诊断和有效的治疗，寻找肺癌发生发展过程中的早期效应生物学标志成为肺癌研究的焦点。端粒是由非编码TTAGGG重复和相关的端粒结合蛋白组成的核蛋白复合物，其主要功能是维护染色体的完整性和稳定性，防止染色体的降解和融合[4]。许多研究[5-6]都在探索端粒缩短与癌症危险性的关系，但结果仍有争议。目前关于端粒长度与肺癌关系的研究尚无定论。Jang等[5]报道外周血基因组DNA端粒缩短可能是肺癌的一个危险因素，但Shen等[6]研究却发现肺癌患者血液中端粒相比正常对照变长。作者应用荧光定量PCR法测定肺癌患者、正常对照的外周血基因组DNA端粒长度，探讨外周血基因组DNA端粒长度与肺癌的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象200例肺癌患者选自2009年1月至2010年5月郑州大学第一附属医院呼吸内科确诊病例,均经病理学或细胞学证实为原发性肺癌，其中鳞状细胞癌87例，腺癌72例，其他类型41例；Ⅰ+Ⅱ期55例，Ⅲ+Ⅳ期145例。200例正常对照选自郑州大学第一附属医院正常体检人群，体检中未发现肺部或其他器官肿瘤。经知情同意后由专业调查员和医生收集一般资料并采集标本。一般资料包括性别、年龄、吸烟史等，其中吸烟的定义为1支/d且吸烟1 a以上。

1.2外周血基因组DNA的提取抽取研究对象静脉血3 mL，外周血基因组DNA提取按照上海莱风生物技术公司DNA提取试剂盒说明进行操作。提取的DNA用紫外分光光度计测吸光度(A)值，选取A(260 nm)/A(280 nm)介于1.7～2.0的样品用于试验。

1.3相对端粒长度(RTL)的测定采用美国Startagene公司的MX3000P PCR仪，参考实时荧光定量PCR 法[7]进行RTL测定。端粒基因的引物序列Tel1：5’-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3’,Tel2：5’-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3’。内参引物序列GAPDH1：5’-TACTAGCGGTTT TACGGGCG-3’，GAPDH2：5’-GAACAGGAGGAGCA GAGAGCGA-3’。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系：2×SYBY q PCR Master Mix(Promega, 美国)10 μL, 10 mmol/L引物0.5 μL，模板DNA 2 μL。反应条件： 95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s,61 ℃ 1 min，40个循环。用PCR仪自带的软件分析数据。根据阴性对照和基线确定Ct值，并根据溶解曲线确定Ct值的有效性。每个样品均做3个平行样并取均值作为该样品的Ct值，每一轮PCR反应均设一个阴性对照以排除假阳性结果。ΔCt=Ct目的基因-Ct内参，ΔΔCt=ΔCt样本-ΔCt内参，以2-ΔΔCt表示RTL。

1.4统计学处理应用SPSS 12.0进行数据分析。2组性别构成、吸烟状态的比较用χ2检验；2组年龄、RTL的比较，不同临床病理特征患者RTL的比较采用两独立样本t检验或单因素方差分析；采用非条件logistic回归分析RTL与肺癌危险性的关系；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组外周血基因组DNARTL的比较研究对象的一般情况见表1。2组年龄、吸烟状态构成差异有统计学意义，故分层比较RTL，见表2。

表1 2组研究对象的一般特征

表2 2组外周血基因组DNA RTL的比较

2.2RTL与肺癌危险性的logistic回归分析按对照组RTL的中位数为分界点，分别将2组分成2层(RTL>0.95和≤0.95，分别赋值0和1),将RTL、年龄、吸烟状态纳入非条件logistic回归方程，结果见表3。

2.3不同临床病理特征肺癌患者外周血基因组DNARTL的比较见表4。

表3 非条件logistic回归分析结果

表4 不同临床病理特征肺癌患者RTL的比较 例

3 讨论

端粒的作用是保护染色体的完整性和稳定性，但极易受外源性理化因素的攻击。正常体细胞中染色体按照传统的机制复制造成端粒复制不完全，因末端复制问题导致端粒在每个细胞分裂周期都会缩短50～100 bp，当端粒缩短到临界长度时，细胞就会出现衰老以致死亡[8]。当有外源性理化因素的刺激时，端粒缩短会越过临界点,使染色体损伤，而染色体损伤可能是肿瘤发生过程中一个重要的遗传学机制。端粒长度变化反映了端粒结构和功能的改变，可作为一项DNA/染色体稳定性改变的早期指标[9-10]。

Han等[11]报道端粒长度与患黑色素瘤的危险性正相关，但与患基底细胞癌风险负相关。Jang等[5]报道外周血基因组DNA端粒缩短可能是患肺癌的一个危险因素。该研究结果表明，肺癌组外周血基因组DNA RTL要短于对照组；非条件logistic回归分析结果表明，将年龄和吸烟状态作为混杂因素进行校正后，按对照组的中位数将RTL分成2层，短端粒患肺癌的风险是长端粒的3.264倍。Jang等[5]亦认为端粒缩短是肺癌的一个危险因素，可以作为肺癌早期的敏感指标。因此，外周血基因组DNA RTL可用于预测患肺癌的风险，且外周血取材方便，适宜随访监测。虽然该研究未发现吸烟水平对端粒长度有影响，但有报道[12]显示端粒长度随着吸烟剂量的增加出现变短的趋势。

该研究结果显示，不同组织学类型和不同临床分期的肺癌患者外周血基因组DNA的RTL差异无统计学意义，提示端粒长度与肺癌的进展可能无关。

综上所述，端粒缩短可增加患肺癌的危险性，可能是肺癌发生发展过程中的早期效应生物学标志，但其与肺癌的进展可能无关；外周血基因组DNA的RTL检测可用于肺癌风险的预测。

[1] 刘天舟，张琳，王庆芳，等.血清CEA、NSE、SCC-Ag和CYFRA21-1联合检测对肺癌诊断的价值[J].郑州大学学报：医学版，2010,45(5)：809

[2] 肖锋，张为民，张文颖.EMT和IGF-IR表达与吉非替尼二线治疗晚期非小细胞肺癌疗效的关系[J].解放军医学杂志,2011，36(6)：563

[3] 韩越，梁军，吕红英，等.晚期非小细胞肺癌ERCC1 XRCC1基因多态性与铂类化疗疗效研究[J].中国实用内科杂志，31(8)：638

[4] 黄东海.质粒介导的RNA干扰肺癌端粒酶逆转录酶研究 [D]. 广州:广州医学院, 2010.

[5] Jang JS, Choi YY, Lee WK,et al.Telomere length and the risk of lung cancer[J].Cancer Sci, 2008, 99(7):1385

[6] Shen M, Cawthon R, Rothman N, et al.A prospective study of telomere length measured by monochrome multiplex quantitative PCR and risk of lung cancer[J].Lung Cancer, 2011, 73(2):133

[7] 王威，李智涛，祝寒松，等. 煤焦沥青烟提取物致BEAS-2B恶性转化细胞端粒蛋白的变化[J]. 中华劳动卫生职业病杂志，2011, 29(9)：678

[8] 宾萍. 多环芳烃暴露对端粒长度的影响及易感性生物标志研究[D].北京:中国疾病预防控制中心, 2008.

[9] Jerry W, Woodring E. Role of telomeres and telomerase in cancer[J].Seminars in Cancer Biology,2011,21(6): 349

[10]林里，李涛平.阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者端粒长度的变化及意义[J].南方医科大学学报，2011，31(3)：457

[11]Han J, Qureshi AA, Prescott J, et al. A prospective study of telomere length and the risk of skin cancer[J]. J Invest Dermatol，2009，129(2):415

[12]Morla M, Busquets X, Pons J, et al. Telomere shortening in smokers with and without COPD[J]. Eur Respir J, 2006, 27(3):525