野菊花不同萃取部位对肝损伤小鼠肝细胞蛋白合成及小鼠免疫功能的影响*

毕跃琴，叶玉廷，王洋洋，孙轶群，王 盼，阿有梅，毕跃峰#

1)南阳市骨科医院药械科 南阳473000 2)郑州大学药学院 郑州450001

野菊花(Flos Chrysanthemi indici) 来源于菊科植物野菊的干燥头状花序[1]，性微寒，味苦辛，归心肝二经，具有疏风清热解毒的功效。近年来研究[2]表明野菊花对肝具有一定的保护作用。作者在前期研究[3-5]中发现野菊花的主要活性成分为萜类(以倍半萜为主)和黄酮类化合物，并通过工艺研究得到了3个萃取部位的提取物及其主要成分：FCI-A主要含萜类化合物，FCI-B富含萜类和黄酮类化合物，FCI-C主要含总黄酮化合物。作者观察了野菊花不同萃取部位对肝损伤小鼠肝细胞蛋白合成及小鼠免疫功能的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物、试剂与仪器SPF级昆明种小鼠，雄性，体质量(20±2) g，由河南省实验动物中心提供。野菊花采自河南省信阳大别山地区，经郑州大学药学院潘成学副教授鉴定为菊科植物野菊花的干燥头状花序，标本存于郑州大学药学院标本室，标本号201110。野菊花不同萃取部位FCI-A、FCI-B和FCI-C浸膏由作者所在实验室自行制备。羧甲基纤维素钠(分析纯)购自天津市科密欧化学试剂有限公司，1,2-丙二醇(分析纯)购自天津市风船化学试剂科技有限公司，D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-galn)购自美国Sigma公司，联苯双酯滴丸(bifendate pill，BP) 购自浙江万邦药业有限公司。总蛋白(total protein，TP)测试盒、白蛋白(albumin，ALB)测试盒和谷丙转氨酶(alanine aminotransferase， ALT)测试盒均购自南京建成生物工程研究所。CP214电子天平(奥豪斯仪器上海有限公司)，UV-2550分光光度计(日本Shimadzu公司)，Herolab UniCen MR离心机(德国Herolab公司)，318C Microplate Reader 双波长酶标仪(上海三科仪器有限公司)。

1.2药物配制FCI-A、FCI-B、FCI-C以及阳性药物BP以1,2-丙二醇和DMSO溶解后，添加10 g/L羧甲基纤维素钠，各组药物均含体积分数20%丙二醇和体积分数1% DMSO。所有药物均现配现用。

1.3野菊花不同萃取部位对肝损伤小鼠肝细胞蛋白合成的影响各组高、中、低剂量设计根据各部位毒性试验确定。96只雄性昆明种小鼠随机分为12组，每组8只，分别为正常组，模型组，FCI-A低、中、高剂量组(分别给予0.5、1.0、2.0 g/kg)、FCI-B低、中、高剂量组(分别给予0.75、1.50、3.00 g/kg)、FCI-C低、中、高剂量组(分别给予1.0、2.0、4.0 g/kg)，BP组(0.2 g/kg)。各给药组按0.02 mL/(g·d)剂量灌胃给药，正常组和模型组给予相应体积的溶媒，连续灌胃给药7 d。于末次给药1 h后，除正常组腹腔注射等量生理盐水外，其余各组均腹腔注射100 g/L D-galn(0.8 g/kg)，禁食不禁水，24 h后小鼠称质量，眼静脉取血，3 000 r/min离心10 min，取血清,按照测试盒说明分别测定TP、ALB水平及ALT活性。颈椎脱臼处死各组小鼠，快速摘取肝、脾，生理盐水洗去血迹，滤纸拭干，用分析天平称取质量，计算肝、脾指数[6]。

1.4野菊花不同萃取部位对小鼠免疫功能的影响

1.4.1 小鼠碳粒廓清实验 另取88只小鼠随机分为11组，每组8只。空白组，阳性对照组[醋酸泼尼松0.02 mg/(g·d)]，FCI-A、FCI-B及FCI-C低、中、高剂量组分别按 1、3、6 mg/(g·d)灌胃给予相应药物，连续7 d。末次给药1 h后，尾静脉注射印度墨水0.01 mL/g，于2 min和10 min后眼眶取血20 μL，加入2 mL 1 g/L Na2CO3溶液中，于630 nm处测吸光度值。常规方法计算廓清指数、吞噬指数。

1.4.2 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 再取64只小鼠随机分为8组，每组8只，FCI-B低、中、高剂量组，FCI-C低、中、高剂量组，空白组和阳性对照组同1.4.1中处理，连续7 d。实验前48 h腹腔注射0.5 mL 10 g/L溶解淀粉作为小鼠腹腔巨噬细胞的诱导物。末次给药1 h后，每只小鼠腹腔注射体积分数2%的鸡红细胞悬液1 mL，轻揉腹部，使细胞液分散。间隔30 min处死小鼠。正中剪开腹壁皮肤，腹腔注射生理盐水2 mL,转动鼠板1 min。吸出1 mL腹腔液, 分别滴于两片载玻片上，置37 ℃恒温箱内30 min。以冰丙酮/甲醇(VV=11)固定15 min。40 g/L Giemsa染液染色3 min，蒸馏水漂洗，晾干。油镜下镜检，计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞及被吞噬的鸡红细胞总数，常规方法计算吞噬率和吞噬指数。

1.5统计学处理采用SPSS 17.0处理数据。应用单因素方差分析比较各组小鼠肝、脾指数和血清TP、ALB水平及ALT活性及各免疫指标的差异，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1野菊花不同萃取部位对肝损伤小鼠肝、脾指数的影响模型组小鼠肝、脾指数较正常组升高，而野菊花不同萃取部位组小鼠肝、脾指数较模型组不同程度地降低，其中FCI-A、FCI-B高剂量组小鼠肝、脾指数明显降低，而FCI-C组小鼠脾指数明显降低，趋于正常。见表1。

表1 野菊花不同萃取部位对肝损伤小鼠肝、脾指数的影响 %

#:与正常组相比，P<0.05；*:与模型组相比，P<0.05。

2.2野菊花不同萃取部位对肝损伤小鼠血清TP、ALB水平及ALT活性的影响模型组小鼠血清TP、ALB水平较正常组降低，ALT活性升高，而FCI-A和 FCI-B组小鼠血清TP、ALB水平较模型组升高，以FCI-B组更明显(P<0.05)。见表2。

表2 野菊花不同萃取部位对肝损伤小鼠血清TP、ALB水平及ALT活性的影响

#: 与正常组相比，P<0.05；*:与模型组相比，P<0.05。

2.3野菊花不同萃取部位对小鼠体内碳粒廓清功能的影响碳粒廓清实验结果显示FCI-B、FCI-C对吞噬指数有影响，FCI-A对吞噬指数无明显影响。见表3。

表3 野菊花不同萃取部位对小鼠体内碳粒廓清功能的影响

*:与空白组比较，P<0.05。

2.4野菊花不同萃取部位对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响与空白组比较，FCI-B、FCI-C低剂量组巨噬细胞吞噬指数升高，高剂量组巨噬细胞吞噬指数降低。见表4。

表4 野菊花不同萃取部位对巨噬细胞吞噬功能的影响

*:与空白组比较，P<0.05。

3 讨论

肝脏是机体重要的代谢器官，在糖、脂类与蛋白质等代谢中均有重要作用[7-8]。蛋白质在机体内具有运输、营养、凝血与抗凝血、免疫作用以及维持pH值与血液渗透压等生理功能[9]。D-galn为肝细胞毒剂，竞争性与磷酸尿苷结合而抑制肝细胞核酸、糖蛋白与脂糖等的合成，从而使肝细胞受损。大剂量D-galn可引起严重的肝细胞损伤，且该损伤的病理学特征与人类病毒性肝炎极为相似[10]。现代医学表明肝损伤时，肝血窦内淤血，中央静脉回流受阻，门静脉内压升高，可致脾脏充血，肿大，继发脾功能亢进。由此可见肝脏病变可波及脾，所以除肝指数外，该研究同时选取了脾指数作为检测指标。该实验结果显示，FCI-A、FCI-B可不同程度地降低肝损伤小鼠肝、脾指数，特别是脾指数，保护受损肝、脾组织。

血清内主要的蛋白质几乎全部由肝脏制造，故测定血清蛋白的水平并分析其成分，可了解肝脏合成功能的状态。肝脏合成的蛋白主要为ALB及大部分α、β球蛋白。急、慢性肝损伤时，血清TP浓度都会减少，但慢性损伤时，γ球蛋白常升高，致使TP水平变化不大，故单凭血清TP水平难以正确估测肝脏合成功能。肝脏合成ALB呈限速性，仅在体内过量ALB丢失或被破坏的情况下，其合成速率才会增加。ALB一旦在肝细胞粗面内质网合成后，便经高尔基体分泌入肝窦。肝损伤时，ALB的合成、细胞内运输和释放发生障碍，进而引起血清ALB减少[11]。该实验中，FCI-A和FCI-B可以不同程度地提高肝损伤小鼠血清TP、ALB水平，尤以FCI-B作用更明显，而FCI-C对提高肝损伤小鼠蛋白合成能力作用不明显，提示增强肝蛋白合成功能的主要活性成分可能为萜类化合物，而黄酮类对其有一定的协同作用，值得进一步研究。

ALT正常存在于肝细胞胞质中，当肝细胞发生坏死，细胞膜破裂或肝细胞变形，细胞膜通透性增高时，血清ALT活性升高。ALT活性可反映肝细胞变性、坏死程度，为检查肝功能损害的一个灵敏指标[12]。该研究中，FCI 3个萃取部位某些剂量在一定程度上能降低肝损伤小鼠血清ALT活性。

小鼠体内碳粒廓清、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验都是机体固有免疫功能的检测指标。小鼠体内碳粒廓清实验显示FCI-A对其影响较小，故巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验只测了FCI-B、FCI-C。实验结果显示，低剂量的FCI-B、FCI-C均能提高吞噬指数，高剂量FCI-B、FCI-C可降低吞噬指数，说明FCI-B、FCI-C对免疫具有双向调节作用。关于免疫调节的量效关系，尚需进一步深入研究。

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