鸡血藤总黄酮对酒精性肝损伤的保护作用及机制

亢泽春 刘少华 高 聪(滨州医学院，山东 烟台 264003)

酒精性肝病是一进行性疾病，早期的病理改变为肝细胞氧化损伤，一旦发展到晚期则难以逆转和治愈。黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗氧化、解酒等作用〔1，2〕。相关研究表明〔3〕，鸡血藤提取物总黄酮有抗氧化及保肝作用。本实验以鸡血藤总黄酮作为解酒及保肝剂，在构建小鼠酒精性肝损伤模型基础上，观察鸡血藤总黄酮的解酒及保肝作用。

1 材料与方法

1.1 动物 健康昆明种小鼠，雌雄各半，体重(25±2)g，滨州医学院动物实验中心提供(许可证号:20100009)。

1.2 试剂 鸡血藤总黄酮(滨州医学院药物研究所提供，含量85%)，56%(v/v)二锅头白酒(北京红星股份有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号20101211、20101208、20101112;氯化钠注射液(山东科伦药业有限公司，批号091130);无水乙醇(烟台三和化学试剂有限公司，批号090730)。

1.3 仪器 IR16-A高速冷冻离心机(北京雷勃尔离心机有限公司)，UV757CRT紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，HH-4数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)，BS-200全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份公司)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及给药 取小鼠60只，适应性喂养3 d后随机分为5组:空白组、模型组、鸡血藤总黄酮低、中、高剂量组，每组12只。空白组给予生理盐水20 ml/kg，1次/d，鸡血藤总黄酮剂量分别为0.1、0.2、0.4 g/kg;模型组20 ml/kg生理盐水。均连续灌胃给药7 d。

1.4.2 急性酒精性肝损伤造模 除空白组外，其余各组均在末次给药1 h后，一次性给予56%(v/v)的红星二锅头酒10 ml/kg。空白组给予等量的生理盐水灌胃。

1.4.3 指标测定及方法 记录小鼠的耐受酒精时间(从灌酒到翻正反射消失)和醉酒时间(从翻正反射消失到翻正反射重新开始)，比较各组间的差异。小鼠禁食16 h后，摘除眼球取血，离心血清，应用BS-200全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)，总胆红素(TB)含量。取小鼠肝脏，用冷生理盐水冲洗后制备匀浆，离心后取上清，测定SOD，GSH-Px及MDA活性，参照试剂盒说明书操作。取小鼠肝脏，用10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察。取小鼠肝脏，胰酶消化后低温高速离心机离心得肝细胞，流式细胞术测肝细胞线粒体膜电位。取10%肝组织匀浆，低温低速离心沉淀后，将上清低温高速离心15 min，得沉淀即为线粒体，参照文献方法测定线粒体呼吸链酶复合体Ñ+Ó、Ò+Ó活性。

1.5 统计学方法 应用SPSS12.1统计软件，计量资料以s表示，组间比较用t检验。

2 结果

2.1 对小鼠酒精耐受时间和醉酒昏睡时间的影响 高剂量鸡血藤总黄酮组小鼠酒精耐受时间较模型组增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。而低、中剂量组与模型组相比，差异无统计学意义(P＞0.05);鸡血藤总黄酮各剂量组均可明显缩短醉酒时间(P＜0.01)。见表1。

2.2 对酒精性肝损伤小鼠肝功能的影响 与空白组相比，模型组小鼠ALT，AST，TB含量均明显升高(P＜0.01);鸡血藤总黄酮高、中剂量组ALT，AST，TB含量与模型组相比明显降低(P＜0.01)。见表2。

表1 鸡血藤总黄酮对小鼠醉酒时间和耐受时间的比较( s，n=12，min)

表1 鸡血藤总黄酮对小鼠醉酒时间和耐受时间的比较( s，n=12，min)

与模型组比较:1)P＜0.01

耐受时间 醉酒时间空白组组别 死亡数(n)0--模型组 4 13.10±3.13 156.63±16.12鸡血藤总黄酮高剂量组 3 23.25±5.751)112.22±14.291)鸡血藤总黄酮中剂量组 2 19.33±11.05 124.90±13.73鸡血藤总黄酮低剂量组4 18.45±8.07 132.50±14.74

表2 鸡血藤总黄酮对酒精性肝损伤小鼠血清肝功能指标的影响( s，n=12)

表2 鸡血藤总黄酮对酒精性肝损伤小鼠血清肝功能指标的影响( s，n=12)

与空白组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01，下表同

组别 ALT(IU/L)AST(IU/L)TB(μmol/L)34.69±10.81 49.57±15.23 9.21±4.07模型组 208.02±25.061)452.60±157.811)55.67±24.461)鸡血藤总黄酮高剂量组 100.74±11.172)213.37±90.272)30.88±12.362)中剂量组 135.86±32.272)320.64±104.512)37.19±9.542)低剂量组空白组197.78±20.01 387.16±125.29 49.23±20.03

2.3 对酒精性肝损伤小鼠肝组织氧化应激指标的影响 模型组SOD，GSH-Px活性和 MDA水平与空白组相比，差异显著(P＜0.01)。与模型组相比，鸡血藤总黄酮中、高剂量组SOD，GSH-Px活性明显升高(P＜0.01)，MDA水平明显降低(P＜0.01)。见表3。

2.4 对小鼠肝脏组织学病理变化的影响 光镜下观察到空白组小鼠肝组织结构完整、清晰，肝小叶结构正常;模型组可见肝索紊乱、胞质疏松，胞质内可见大小不一的脂滴空泡，窦内皮细胞肿胀、增生，汇管区有炎细胞浸润，肝小叶出现点状坏死;鸡血藤总黄酮各给药组小鼠肝组织也见肝细胞变化，但程度较模型组明显减轻。见图1。

表3 鸡血藤总黄酮对酒精性肝损伤小鼠氧化应激的影响( s，n=12)

表3 鸡血藤总黄酮对酒精性肝损伤小鼠氧化应激的影响( s，n=12)

组别SOD(U/mgprot)GSH-Px(U/mgprot)MDA(nmol/mg)193.68±21.20 12.98±3.21 3.18±0.61模型组 92.20±10.401)6.62±2.831)10.49±2.051)鸡血藤总黄酮高剂量组 180.54±17.172)11.44±4.452)6.73±1.102)鸡血藤总黄酮中剂量组 162.45±18.132)9.22±2.072)7.94±1.122)鸡血藤总黄酮低剂量组空白组109.04±25.07 7.39±2.75 9.01±1.59

图1 鸡血藤总黄酮对酒精性肝损伤小鼠肝组织形态学的影响(HE，×400)

2.5 对小鼠线粒体酶和线粒体膜电位的影响 与空白组相比，模型组小鼠呼吸链酶复合体Ñ+Ó、Ò+Ó活性显著下降(P＜0.01)。与模型组相比，鸡血藤总黄酮高中剂量组能明显提高小鼠呼吸链酶复合体Ñ+Ó、Ò+Ó活性(P＜0.01)。与空白组相比，模型组小鼠线粒体膜电位明显下降(P＜0.01)。与模型组相比，鸡血藤总黄酮高、中剂量组小鼠线粒体膜电位明显升高(P＜0.01)。见表4。

表4 鸡血藤总黄酮对酒精性肝损伤小鼠线粒体酶和线粒体膜电位的影响( s，n=12)

表4 鸡血藤总黄酮对酒精性肝损伤小鼠线粒体酶和线粒体膜电位的影响( s，n=12)

组别 Ñ+Ó Ò+Ó Δψm 11.68±1.21 21.93±2.33 1.00±0.09模型组 2.29±0.141) 4.26±0.831) 0.35±0.021)鸡血藤总黄酮高剂量组 10.54±1.172) 11.44±4.452) 0.89±0.062)鸡血藤总黄酮中剂量组 6.24±0.832) 9.22±2.072) 0.78±0.032)鸡血藤总黄酮低剂量组空白组3.04±0.07 7.39±2.75 0.49±0.04

3 讨论

长期大量酒精摄入引起酒精性肝病的发生，其发病机制尚不清楚。近年来，学术界普遍认为氧化应激在酒精性肝损伤中起着重要的作用。而引起肝损伤的氧化应激是由自由基所诱导。自由基通过激活膜上的磷酸化酶或者攻击肝细胞膜上的磷脂分子而使细胞发生脂质过氧化反应，也可通过与肝微粒体上的脂质和蛋白质共价结合而损伤膜结构。而脂质过氧化反应也会导致线粒体细胞膜损伤，线粒体膜电位下降，线粒体内酶活性下降〔4～6〕。SOD是重要的分布于生物体内的抗氧化酶，发挥清除体内氧自由基，防止细胞结构损伤的作用，SOD活性大小反映自由基的清除速度。MDA是脂质过氧化反应的终末产物，反映脂质过氧化程度，间接反映肝损伤的程度〔7〕。GSHPx反映机体抗氧化能力，它和SOD，过氧化氢酶(CAT)共同清除体内的活性氧，从而减轻和阻止活性氧的损伤作用〔8〕。GSHPx不仅能清除过氧化氢和氢过氧化物，而且能够使脂质过氧化物(LPO)变成无毒的羟化物，防止细胞膜和其他细胞器免受过氧化损伤。本实验说明应用鸡血藤总黄酮后，小鼠的肝氧化损伤程度减轻，鸡血藤总黄酮对乙醇所致肝损伤有保护作用。ALT，AST是判断肝损伤的重要标志。本实验证实，应用鸡血藤总黄酮后，ALT，AST，TB水平较模型组明显下降，进一步证实了鸡血藤总黄酮的保肝作用。通过测定线粒体膜电位，观察线粒体的完整性。而线粒体呼吸链上复合体的活性决定了线粒体的产能情况。复合体Ñ和Ó是电子传递入口，而复合体Ó向下传递电子并伴随能量的产生，故复合体Ñ+Ó和复合体Ò+Ó活性反映线粒体的功能。该实验中鸡血藤总黄酮可提高线粒体膜电位并增强肝线粒体酶复合体Ñ+Ó、Ò+Ó活力。而鸡血藤总黄酮对线粒体的保护作用又可能是由于其抑制脂质过氧化反应，增强内源性抗氧化酶的活性，减少活性氧的产生。但鸡血藤总黄酮保肝作用机制是否是与线粒体通路有关还有待于进一步研究。

1 谢 玲，黄海潇，张 浩，等.基于抗氧化反应元件的药物筛选模型的建立〔J〕.中国药理学通报，2006;22(12):1525.

2 Chow JM，Shen SC，Huan SK，et al.Quercetin，but not rutin and quercitin，prevention of H2O2-induced apoptosis via antioxidant activity and heme oxygenase 1 gene expression in macrophages〔J〕.Biochem Pharmacol，2005;69:1839.

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5 杨明杰，周建嫦，黄俊明，等.酒精性肝病发生机制研究进展〔J〕.中国公共卫生，2003;19(3):367.

6 刘 爽，姚 平，李 珂，等.槲皮素对大鼠原代肝细胞酒精性氧化损伤的防护作用〔J〕.营养学报，2007;29(3):288.

7 潘春芬，肖秀华，田恩圣，等.鸡血藤体外对肝匀浆MDA生成及蛋白质糖基化作用〔J〕.中华医学全科杂志，2004;3(3):26.

8 黄锁义，罗建华，张丽丹，等.鸡血藤总黄酮的提取及对羟自由基的清除作用研究〔J〕.时珍国医国药，2007;18(9):3.