视黄醇结合蛋白4在动脉粥样硬化中的作用机制

付 鑫 张彦红 张继红 万 多 邹慕蔚 吴桂平 (沈阳医学院沈洲医院，辽宁 沈阳 110002)

视黄醇结合蛋白4(RBP4)的基因表达是炎症反应的标志〔1，2〕，冠心病(CHD)患者的血浆 RBP4水平显著升高，特别是急性冠脉综合征患者升高更为明显，RBP4是独立于已知的CHD危险因素的又一新的危险因素〔3〕。有研究发现RBP4与FMD(通过血管外超声测定的血流介导的血管扩张值)显著负相关，与血清可溶性黏附分子(sICAM)-1和sE-选择素正相关，内皮细胞可溶性黏附分子的表达可造成血管功能异常，提示RBP4可以抑制内皮细胞的胰岛素活性，导致血管舒张依赖的一氧化氮(NO)水平减弱，促进血管内皮功能紊乱〔4〕。推测RBP4可能在动脉粥样硬化(AS)炎症反应过程中扮演着重要的角色，但其在人体内确切的病理生理功能尚未完全阐明。本文探讨CHD中血清RBP4与炎症因子水平的相关性及RBP4促炎症反应的机制。

1 对象与方法

1.1 对象及分组 所有病例组研究对象来自2011年3月至2012年1月沈阳医学院沈洲医院心内科进行冠脉造影术的患者，其中诊断为CHD的患者50例，诊断为AS的患者50例。对照组由来自本院体检中心的50名健康的自愿者组成。所有研究对象签订知情同意书，同时经过沈洲医院伦理委员会同意。入选标准:(1)年龄55～70岁;(2)肝、肾、甲状腺功能等临床生化指标正常;(3)近期无手术及外伤史;(4)未进行降血脂治疗;(5)取样者之间无血缘关系。最后的统计分析中，包含了50名来体检的普通人群〔平均年龄(51±3)岁，女性所占比例为42%〕，和50名经冠脉造影确诊为AS的患者〔平均年龄(58±4)岁，女性所占比例为34%〕。收集患者空腹12 h后的肝素抗凝全血，4℃ 4 000 r/min离心10 min，分离血浆及血细胞，用EP管分装后贮存于－80℃。采用ELISA方法检测血清RBP4、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、白细胞介素-6(IL-6)的表达情况。

1.2 RBP4在AS小鼠模型中的表达

1.2.1 实验分组及动脉AS模型的建立 SPF级C57BL/6J 8周龄雄性载脂蛋白E(ApoE)基因敲除(Apo E－/－)小鼠10只为模型组，另以10只8周龄雄性C57BL/6J作为空白对照组。模型组小鼠给予高脂饲料喂养，空白对照组小鼠给予普通饲料喂养。连续喂养6 w。

1.2.2 标本采集和组织学观察 于实验第6周后取血处死动物。禁食 12 h后摘取眼球取血 1.5 ml，立即离心(4℃，800 r/min，15 min)，－20℃冰箱保存备用。处死动物时，用生理盐水逆行灌注各组小鼠主动脉，自主动脉根部至腹主动脉离断整个血管，切取临近主动脉根部的动脉0.5 cm，纵行剖开展平后，用10%中性缓冲甲醛液固定、常规脱水后用油红O染色观察粥样硬化斑块，显微镜下拍照。

1.2.3 观察指标 采用全自动生化分析仪(美国雅培公司AEROSET)。酶法检测血浆甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)，游离胆固醇(FC)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。采用ELISA方法检测血清RBP4、hs-CRP、MCP-1、IL-6的表达情况。采用RT-PCR法检测斑块组织中RBP4 mRNA的表达水平，采用Western印迹法检测斑块组织中RBP4蛋白及p38、c-jnk氨基末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)表达水平。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，数值变量以s表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组间进一步的比较采用SNK检验。

2 结果

2.1 各组临床及实验室指标比较 AS组、CHD组与对照组比较，TG、HDL-C、RBP4、IL-6 存在显著差异，而 TC、FC、hs-CRP、MCP-1仅在CHD组与对照组间存在显著差异。见表1。

表1 各组的临床及实验室指标比较( s，n=50)

表1 各组的临床及实验室指标比较( s，n=50)

与CHD组比较:1)P＜0.01;与AS组比较:2)P＜0.05

项目 对照组 AS组 CHD组51±3 56±4 58±4男/女(n)29/21 30/20 33/17 TC(mmol/L)4.08±0.5 4.09±0.69 4.78±0.561)TG(mmol/L)1.16±0.36 1.76±1.042) 1.81±0.641)FC(mmol/L)2.12±0.2 2.2±0.23 3.0±0.31)HDL-C(mmol/L)1.32±0.23 0.93±0.211) 0.84±0.111)RBP4(μg/ml)23.0±1.5 32.6±1.2 41.7±1.3 hs-CRP(mg/L)1.66±0.99 1.81±1.07 3.93±2.44 MCP-1(ng/L)0.18 ± 0.04 0.21±0.05 0.5±0.05 IL-6(ng/L)年龄(岁)2.1±0.14 3.0±0.22 6.0±0.31

2.2 RBP4与各种危险因素相关性分析 年龄、性别、TC、TG、FC 对RBP4 活性无显著相关(r分别为0.1、0.02、0.054、0.053、0.074，均 P＞0.05);而 RBP4与 hs-CRP(r=0.38，P ＜0.001)、IL-6(r=0.45，P ＜0.001)、HDL-C(r=0.56，P ＜0.01)，MCP-1(r=0.47，P ＜0.01)呈正相关。

2.3 小鼠指标检测

2.3.1 各组血脂水平比较 模型组高脂6 w后，血脂水平明显升高(P＜0.05)。见表2。

表2 对照组与模型组高脂前后血脂比较( s，mg/dl，n=10)

表2 对照组与模型组高脂前后血脂比较( s，mg/dl，n=10)

与对照组比较:1)P＜0.05;与模型高脂前比较:2)P＜0.05

TC 250.4±42.0 556.7±30.11)1 343.7±120.41)2)TG 91.4±9.7 85.0±10.0 143.9±31.11)2)FC 112.3±21.7 224.8±20.51) 407.8±33.51)2)HDL-C 11.9±3.2 12.1±3.0 12.4±2.7

2.3.2 胸腹主动脉AS斑块面积分析 两组主动脉血管壁均有斑块形成，尤以主动脉弓处脂质沉积较多，各组斑块面积大小不等。胸腹部主动脉AS斑块面积，两组小鼠之间有统计学差异(P＜0.05)。见图1，表3，表4。

图1 模型组高脂前与高脂后斑块比较(×100)

表3 模型组小鼠主动脉窦AS斑块定量分析( s，n=10)

表3 模型组小鼠主动脉窦AS斑块定量分析( s，n=10)

与高脂前比较:1)P＜0.05;下表同

组别 斑块面积(μm2)斑块面积/管腔面积(%)75 231±8 675 10.83±2.11高脂后 93 461±6 3451) 15.33±1.431)高脂前

表4 模型组小鼠胸腹主动脉AS斑块定量分析( s，n=10)

表4 模型组小鼠胸腹主动脉AS斑块定量分析( s，n=10)

组别 斑块面积(μm2)斑块面积/管腔面积(%)23 659±479 14.83±1.21高脂后 37 575±5221) 21.27±2.201)高脂前

2.3.3 模型组小鼠高脂前和高脂后RBP4蛋白水平的比较与对照组(0.86±0.14)相比，AopE－/－小鼠肝脏 RBP4、蛋白水平显著增加(高脂前组1.31±0.37，高脂6 w后组1.83±0.29)(P＜0.01)。见图2。

2.3.4 各组P38、JNK、ERK蛋白水平比较 见图3。与对照组相比，模型组小鼠P38、JNK蛋白水平显著增加(P＜0.01)，P38蛋白水平在高脂前组(0.93±0.08)、高脂6 w后组(1.51±0.63)、对照组(0.71±0.33);JNK蛋白水平在高脂前组(1.37±0.42)，高脂6 w 后组(1.49±0.65)、对照组(0.70±0.29)。ERK蛋白水平高脂前组(0.73±0.32)、高脂6 w后组(0.68±0.41)、对照组(0.69±0.31)，但ERK在三组之间没有显著性差异(P＞0.05)。

3 讨论

炎症反应在AS的发生发展中起着重要的作用，并且贯穿于AS斑块形成、生长到破裂的全过程〔5～7〕。因此，干预炎症反应与干预脂质代谢成为防治AS的两大主要治疗手段〔8〕。

脂肪细胞因子的分泌失衡或功能障碍在胰岛素抵抗(IR)及心血管疾病的病理生理过程中发挥重要作用，被视为IR和心血管疾病可能的中间环节〔5〕。脂肪组织不仅具有储存能量的功能，还是机体最大的内分泌器官，能产生和分泌多种生物活性物质，统称为脂肪细胞因子，包括脂联素、瘦素、抵抗素等，这些激素通过内分泌、旁分泌和自分泌的途径发挥作用，参与IR和慢性炎症的病理生理过程〔9〕。

RBP4是由脂肪细胞和肝分泌的一种蛋白质分子，可能促进全身IR，其编码的基因位于10q23～q24，mRNA全长941 bp，其编码的蛋白质由201个氨基酸组成，主要由肝脏分泌，参与肥胖与IR发生机制。在肥胖、糖耐量受损、或2型糖尿病病人以及在有2型糖尿病家族史的非肥胖及非糖尿病的人群中，血清RBP4水平增高，血清RBP4水平与伴随IR的心血管病危险因素密切相关。近年来研究发现，脂肪组织也参与了炎症反应。CHD患者血清RBP4显著升高，且常伴随炎症因子表达增多，研究结果示血清RBP4与血清脂联素、血白细胞和hs-CRP水平相关〔10〕;RBP4 mRNA 与 MCP-1 和 CD68 呈正相关〔11〕，在IR的几个小鼠模型中，血液中RBP4水平明显升高，在患肥胖症和糖尿病人类研究中，同样发现其含量的增加。如前所述，在啮齿类动物血液中RBP4与IR高度相关，但在人类的研究中，情况却不尽相同〔4，12〕。目前尚不清楚为什么在人群中存在这种差异。本研究中，RBP4在AS患者和CHD患者中的水平显著增加，特别是CHD患者体内;同时在CHD患者中，hs-CRP和MCP-1也显著增加，说明在AS逐渐转化为CHD的过程中，炎症反应越来越明显。同时，小鼠体内的数据也证明无论是在器官内，还是在外周血液中，RBP4含量都随着AS的逐渐进展而越来越多。

炎症反应是一个复杂的网络调控过程，MAPKs是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路存在于大多数细胞内，是真核细胞转导细胞外信号到细胞内引起细胞反应的四大信号系统之一，参与细胞生长、发育及细胞间功能同步等多种生理功能。目前已经鉴定的MAPKs信号转导通路家族包括 P38、ERK、JNK、ERK3、ERK5/BMK1、ERK-7、NLK和ERK8等八个亚家族，这些亚族组成多条通路，其中p38和JNK主要对炎性细胞因子和多种类型的细胞应激信号进行传导，而ERK主要对细胞生长、分裂和分化信号进行传导〔13〕。已有的研究表明p38、ERK和JNK三种通路均参与了 AS的病理过程〔14〕。本课题发现 p38及 JRK在ApoE－/－小鼠体内表达明显增多，而ERK在三组中无明显差异性，主要可能因为P38及JNK参与炎性细胞因子和多种类型的细胞应激信号传导，而ERK参与了细胞的生长、分裂和分化信号传导。

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