人白细胞介素32γ基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

李松林 朱妍妍 李 霏 尹元琴 (中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所，辽宁 沈阳 110001)

白细胞介素(IL)-32首先由Kim等〔1〕于2005年利用基因芯片技术研究IL-18诱导高表达基因时发现的一种高表达细胞因子样基因，编码炎症性细胞因子，命名为白细胞介素32(IL32)。IL32存在 6种剪接变体，Choi等〔2〕研究发现 IL-32γ是IL-32活性最强的剪接变体。近来，Oh等〔3〕进一步研究证实IL-32γ能够通过灭活NF-κB和STAT3信号蛋白抑制肿瘤细胞的增殖。为深入探讨IL-32γ在肿瘤细胞增殖分化过程中的可能作用，我们利用腺病毒具有较高的感染效率、腺病毒载体不整合到染色体中、携带的外源基因表达水平高等优点，构建了人IL-32γ基因的重组腺病毒表达载体，并对重组腺病毒载体Ad-IL-32γ的感染效率和表达进行观察和检测。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒 DH5α化学感受态菌株，真核表达质粒pDONR223，pAdxsi腺病毒质粒及pShuttle-CMV(-)重组穿梭载体由本实验室提供。

1.2 主要试剂 Platinum Pfx DNA Polymerase试剂盒购自invitrogen公司;引物合成于大连宝生物公司;所用限制性内切酶均购自New England Biolabs公司;质粒小/中量提取纯化试剂盒、DNA纯化试剂盒 (柱离心型)、DNA凝胶回收与纯化试剂盒(柱离心型)均购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司;真核转染试剂Lipofectamine2000为GIBCO BRL产品;1 kb DNA ladder购自鼎国生物公司。鼠抗人IL-32γ抗体购自Biolegend公司;鼠抗人β-actin抗体购自Santa Cruz公司;羊抗鼠二抗购自中杉公司。

1.3 方法

1.3.1 IL-32γ基因片段的克隆 参照IL-32γ序列设计引物IL-32γ-KpnI-前向:CGGGGTACCACCATGTGCTTCCCGAAG，IL-32γ-EcoRI-反向:CCGGAATTCTCATTTTGAGGATTG。以 pOTB7/IL-32γ为模板，采用Platinum Pfx DNA Polymerase高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，获得 IL-32γ基因片段。

1.3.2 重组穿梭载体pShuttle-(ΔGFP)-IL-32γ的构建及鉴定

1.3.2.1 pShuttle-GFP-CMV重组穿梭载体的KpnI/EcoRI酶切 pShuttle-GFP-CMV 10 μl，10 × Buffer 5 μl，10 × BSA 5 μl，KpnI 15 U，EcoRI 1.5 U，ddH2O 35 μl，总体积 50 μl，37 ℃水浴3.5 h。CIP 0.5 μl，37℃水浴0.5 h。酶切完成后进行1%琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收5.1 kb片段。

1.3.2.2 KpnI，EcoRI酶切 IL-32γ 片段 IL-32γ 30 μl，10 ×Buffer 5 μl，10 × BSA 5 μl，KpnI 1.5 μl，EcoRI 1.5 μl，ddH2O 7 μl，总体积 50 μl，37 ℃水浴 3.5 h。酶切完成后进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收0.75 kb片段。

1.3.2.3 载体片段与IL-32γ 片段的连接 IL-32γ 6 μl，pShuttle-GFP-CMV 2 μl，10 × ligase Buffer 1 μl，T4 DNA ligase 1 μl，总体积10 μl，22℃水浴3.5 h。取3 μl连接产物转化化学感受态细胞DH5α菌株，涂布到卡那抗性固体培养基平皿，37℃培养箱中培养过夜。挑取若干单克隆菌落，接种到卡那抗性液体培养基中，摇床中37℃ 300 r/min振荡培养过夜。参照威格拉斯质粒小/中量提取纯化试剂盒说明书提取质粒。KpnI/EcoRI酶切鉴定:pShuttle-(ΔGFP)-IL-32γ 1 μl，10 × Buffer 1 μl，10 × BSA 1 μl，KpnI 1.5 μl，EcoRI 1.5 μl，ddH2O 6.7 μl，总体积 10 μl，37℃水浴1.5 h。阳性克隆将得到0.75 kb条带。

1.3.3 重组腺病毒载体Ad-IL-32γ的构建及鉴定 腺病毒载体pAdxsi的+酶切，I-CeuⅠ10 U，I-SceⅠ 10 U，反应体系同1.3.2.1。乙醇沉淀法回收载体:酶切体系加ddH2O 100 μl，酚75 μl，氯仿 75 μl，充分混匀，12 000 r/min 离心5 min;吸上清至新的离心管中，加入3 mol/L pH5.2的醋酸钠20 μl，再加入无水乙醇500 μl，－20℃沉淀15 min;4℃离心15 min，小心吸去上清，加入70%乙醇500 μl，4℃离心5 min，小心吸去上清，晾干5 min，加入 ddH2O 100 μl。pShuttle-(ΔGFP)-IL-32γ 的 I-CeuⅠ+I-SceⅠ酶切:操作同1.3.2.2，回收4.4 kb片段。将腺病毒载体片段及IL-32γ目的片段连接并提取后以XhoⅠ酶切鉴定，操作同1.3.2.3。阳性克隆将得到 14.5、11.7、3.4、2.66、2.47、1.45、0.6 kb 条带。

1.3.4 重组腺病毒载体的扩增、纯化及滴度测定 HEK293细胞按常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基的六孔板中过夜，每孔5×105个细胞。线性化鉴定正确的重组腺病毒载体 Ad-IL-32γ:Ad-IL-32γ 10 μl，10 × Buffer 5 μl，PacⅠ 20 U，ddH2O 39 μl，总体积 50 μl，37 ℃水浴 3.5 h。取线性化的腺病毒载体5 μl稀释于 300 μl DMEM，室温放置 5 min，用 Lipofectamine2000脂质体按说明书转染细胞，转染后6 h换液。每天观察细胞出毒迹象。转染后第13天，出现明显噬斑，细胞大部分脱落，收集细胞及上清，反复冻融3次，3 000 r/min离心5 min，收集上清作为第一代毒种。以后扩增时取2 ml第一代病毒感染一个75 cm细胞培养瓶的细胞，两天后所有细胞脱落转入15 ml离心管中，2 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 ml ST buffer(DMEM培养基+10%胎牛血清+2.5%甘油)，混匀，冻融3次后3 000 r/min离心5 min，取上清，作为新的病毒冻存物进行下一轮扩增。采用TCID50方法测定病毒滴度。将293LP细胞接种至96孔板，将病毒上清从10-8稀释度开始进行8个稀释梯度的稀释并转染细胞，每个稀释度设9个复孔，并设2个阴性对照，转染后第10天进行结果判定。

1.3.5 感染效率测定 取对数生长期的HEK293细胞，以2×106个/孔接种于六孔板中，将Ad-IL-32γ分别以MOI(感染复数)50、100、200感染细胞，48 h后于荧光显微镜下每孔随机取5个视野，计数200个细胞中呈现绿色荧光细胞数，确定感染百分率。

1.3.6 Western印迹法检测IL-32γ的表达 取对数生长期的HEK293细胞，以2×106个/孔接种于六孔板中，分为单纯细胞、感染空腺病毒载体细胞和感染重组腺病毒载体细胞3组。感染48 h后收集各组细胞，用预冷的PBS洗细胞3次，每组细胞加入100 μl细胞裂解液(预冷至0℃)以提取总蛋白，蛋白浓度参照BCA试剂盒测定。煮沸变性的蛋白以每孔40 μg的含量加样，经浓缩胶为6%、分离胶为10%的SDS-PAGE电泳分离。通过电转仪将凝胶上的蛋白样品移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉在37℃封闭2 h。与1∶500鼠抗人IL－32γ抗体4℃孵育过夜。TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗鼠IgG(1∶200)山羊抗兔IgG(1∶200)，室温孵育2 h。洗膜后用化学发光底物显影，凝胶成像。

2 结果

2.1 重组穿梭载体pShuttle-(ΔGFP)-IL-32γ的构建及鉴定经KpnI/EcoRI酶切鉴定结果见图1。重组腺病毒载体Ad-IL-32γ经XhoⅠ酶切鉴定结果，见图2。

2.2 重组腺病毒载体Ad-IL-32γ的感染效率 以感染复数分别为50、100、200的重组腺病毒载体 Ad-IL-32γ感染 HEK293细胞48 h后，荧光显微镜下随机取5个视野观察并计数每200个293细胞中感染细胞数目，计算其感染效率分别为(58.66±3.6)%、(95.69±1.7)%和(97.63±2.8)%。

2.3 Western印迹法检测各组细胞IL-32γ的表达 按单纯细胞、感染空腺病毒载体细胞和感染重组腺病毒载体细胞三组感染HEK293细胞48h后，通过Western印迹法检测HEK293细胞中IL-32γ的表达，可见感染Ad-IL-32γ组细胞表达IL-32γ蛋白，而两对照组未见表达。见图3，图4。

3 讨论

随着细胞生物学、分子生物学研究的深入和DNA重组技术、基因合成技术的飞速发展，肿瘤的生物治疗作为第四种主要治疗模式迅速发展起来。生物治疗是指通过各种方式激发和增强肿瘤患者的免疫功能，其中基因治疗是一个主要的生物治疗方法。生物免疫治疗联合传统的手术、化疗、放疗可以精准清除残余肿瘤细胞，防复发、防转移，提升患者生存质量和时间。这给肿瘤的治疗提供了新的思路。

IL-32参与肿瘤的发生发展过程。IL-32主要是由NK细胞、T淋巴细胞、内皮细胞和血液单核细胞刺激产生的〔4〕。研究发现通过在慢性髓细胞性白血病(CML)中过表达IL-32α能够通过激活p38MAPK途径使CML细胞的Fas和ULBP2表达增加，而这二者的升高会直接导致NK细胞对CML细胞的敏感性增加，从而达到抗癌的效果〔5，6〕。在转染 IL-32γ的结肠癌细胞和接种黑素瘤的IL-32γ转基因鼠中过表达IL-32γ能够通过抑制NF-κB和STAT3途径使促凋亡蛋白活化的 caspase-3，-9和多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶增加，而抗凋亡蛋白如bcl-2、凋亡蛋白抑制剂(IAP)、XIAP、c-FLIP和细胞增殖标记物(包括细胞周期蛋白D细胞周期蛋白激酶4)水平降低，从而起到抑制肿瘤生长的作用〔7〕。

基因治疗研究中，基因转移方法是基因治疗的基础和关键。病毒能与细胞表面受体结合并将其基因组有效导入宿主细胞，因此，可以利用病毒载体进行目的基因转运。腺病毒载体具有宿主细胞范围广、高转移效率、高滴度和高表达等优点，是目前基因治疗研究中应用最为广泛的载体〔8，9〕。本实验中将构建成的Ad-IL-32γ转染HEK239细胞，并通过实时定量PCR法和Western印迹法证实其能够在转染后的细胞内高效表达，Ad-IL-32γ的成功构建为研究IL-32γ基因抑制恶性肿瘤的基因治疗奠定基础。

1 Kim KH，Shim JH，Seo EH，et al.Interleukin-32 monoclonal antibodies for immunohistochemistry.Western blotting，and ELISA〔J〕.J Immunol Methods，2008;333:38-50.

2 Choi JD，Bae SY，Hong JW，et al.Identification of the most active interleukin-32 isoform〔J〕.J Immunol，2009;126:535-42.

3 Oh JH，Cho MC，Kim JH，et al.IL-32gamma inhibits cancer cell growth through inactivation of NF-kappaB and STAT3 signals〔J〕.J Oncogene，2011;30(30):3345-59.

4 Kim SH，Han SY，Azam T，et al.Interleukin-32:a cytokine and inducer of TNF alpha〔J〕.J Immunity，2005;22:131-42.

5 Goda C，Kanaji T，Kanaji S，et al.Involvement of IL-32 in activation-induced cell death in T cells〔J〕.J Int Immunol，2006;18(2):233-40.

6 Cheon S，Lee JH，Park S，et al.Overexpression of IL-32alpha increases NK cell-mediated killing through up-regulation of Fas and ULBP2 expression in human chronic myeloid leukemia cells〔J〕.J Biol Chem，2011;286(14):12049-55.

7 Netea MG，Azam T，Ferwerda G，et al.IL-32 synergizes with nucleotide oligomerization domain(NOD)1 and NOD2 ligands for IL-1beta and IL-6 production through a caspase 1-dependent mechanism〔J〕.J Proc Natl Acad Sci，2005;102:16309-14.

8 Barzon L，Zanusso M，Colombo F，et al.Clinical trials of gene therapy，virotherapy，and immunotherapy for malignant gliomas〔J〕.J Cancer Gene Ther，2006;13(6):539-54.

9 Alexandrova R.Experimental strategies in gene therapy of cancer〔J〕.J Buon，2009;14(Suppl 1):S23-32.