耳针血清对大鼠脑微血管内皮细胞拟糖尿病损伤的保护作用

梅志刚 刘晓洁 曾永保 肖长义 黎家华 胡 卫 陈良金

(三峡大学医学院 国家中医药管理局中药药理科研三级实验室，湖北 宜昌 443002)

糖尿病患者体内高脂、高糖、高胰岛素血症及其他精神因素慢性刺激而引发的内皮细胞损伤过程，包括氧化应激、炎性反应、非酶性糖基化终末产物的形成、蛋白激酶C信号通路和多元醇通路激活以及己糖胺通路活性升高等〔1〕，临床研究发现，电针耳甲区迷走神经分布区穴位具有即时降低血糖，改善糖耐量等作用〔2，3〕;本课题组前期实验研究还发现耳针具有抗炎，减低胰岛素抵抗等作用〔4〕。本研究试图揭示耳针防治糖尿病血管并发症的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康雄性SD大鼠80只，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心〔动物生产许可证号:SCXK(鄂)2010-0007〕，体重200～220 g，适应性饲养1 w后，随机数字表法挑选10只作为正常组大鼠(组1)，以普通饲料喂养。其余70只采用高脂、高糖饲料(蛋白质23%，碳水化合物53%，脂肪5%，纤维19%)饲养8 w后禁食12 h，按35 mg/kg剂量1次性腹腔注射1%链脲佐菌素(STZ)，参照Srinivasan等方法建立2型糖尿病大鼠模型。注射STZ 1 w后尾静脉取血约0.05 ml以Onetouch血糖仪(强生公司)测定空腹血糖(FBG)，并以FBG≥16.7 mmol/L为2型糖尿病大鼠模型。将造模成功的49只大鼠(另外21只大鼠因造模失败或死亡而排除)随机分为:模型组(组2，共6只)、耳针组(组3，共8只)、迷走神经切断组(组4，共7只)、阿托品组(组 5，共8只)、六烃季铵组(组 6，共 7只)和α-银环蛇毒素组(组7，共7只)。各组分别作如下处理:组2动物未作处理，为模型对照;组3:电针刺激大鼠耳胰胆及神门穴，每次30 min(根据预实验结果刺激强度为2 mA，频率10 Hz，脉宽0.4 ms)。组4～7均在给予组3同样的耳穴电针刺激之前作如下处理:组4动物切断耳针刺激侧颈部迷走神经;组5、组6和组7分别给予尾静脉注射阿托品(0.1 mg/kg)、六烃季铵(10 mg/kg)和α-银环蛇毒素(1.0 μg/kg)，上述各组处理1次/d，共计10 d。最后一次处理结束，立即以20%乌拉坦200 g/ml麻醉大鼠，腹主动脉采血，离心收集大鼠血清，以0.22 μm滤膜过滤除菌，－20℃冰箱保存备用。

1.2 大鼠脑微血管内皮细胞培养 大鼠脑微血管内皮细胞株(BMEC)购自上海拜力生物科技有限公司(批号:11875-093)，经免疫荧光细胞化学法检测Ⅷ因子相关抗原蛋白呈阳性表达。正常细胞培养液每100 ml各成分含量为:1640培养液87 ml、胎牛血清10 ml、丙酮酸钠 1 ml、HEPES液 1 ml、1 U 的双抗1 ml。待细胞铺满瓶底时，以0.125%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸钠(EDTA)消化，传代，镜下调整细胞密度为8×103/cm2，传代后每3 d换液1次，传代细胞4～6 d可形成铺路石样紧密分布，传至第4代的细胞用于实验。

1.3 糖尿病血管并发症细胞模型制作及分组处理 将上述正常培养细胞分为7组(每组12孔):正常对照组、模型对照组、针刺组、迷走神经切断组、阿托品组、六烃季铵组、α-银环蛇毒素组。正常对照组以正常培养基培养，其余6组根据笔者以往研究结果〔5〕，分别加入糖尿病血管并发症内皮细胞模型造模条件培养液:含有 20 mmol/L葡萄糖、100 mU/L胰岛素和200 mg/L氧化型低密度脂蛋白的无血清培养基(下简称造模液)，同时分别加入上述实验动物收集的组2～7的耳针血清，并配置成10%的终浓度，即A正常组条件培养液为:1640培养基;B模型组:造模液+10%组2大鼠血清;C针刺组:造模液+10%组3大鼠血清;D迷走神经切断组:造模液+10%组4大鼠血清;E阿托品组:造模液+10%组5大鼠血清;F六烃季胺组:造模液+10%组6大鼠血清;G α-银环蛇毒素组:造模液 +10%组7大鼠血清。各组细胞加入上述条件培养液后于CO2培养箱中培养48 h，观察各组细胞活性及形态学变化。

1.4 指标检测

1.4.1 MTS/PMS比色分析法测定各组细胞的活性 将正常培养的细胞消化后离心重悬，细胞计数板计数，调整细胞密度为(3～5)×104/ml后接种于96孔板中，为防止孔板导致的边缘效应，共接种细胞48孔，每孔100 μl，将接种的细胞分为7组:正常对照组、模型对照组、耳针组、迷走神经切断组、阿托品组、六烃季铵组、α-银环蛇毒素组，每组6孔。接种后24 h待细胞贴壁正常生长后，小心吸走培养基，各组分别加入1.2中所述的条件培养液100 μl，于CO2培养箱中培养48 h后，每孔加50 μl 1×MTT溶液，37℃孵育4 h→吸出上清液→每孔加150 μl二甲基亚砜(DMSO)→平板摇床摇匀→酶标仪在570 nm波长处检测每孔的吸光度值(OD值)。

1.4.2 流式细胞仪观察内皮细胞的凋亡情况 细胞凋亡检测按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行:将细胞条件培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤细胞1次，以胰酶(不含有EDTA)将各组细胞消化下来，加入上述收集的细胞条件培养液，稍混匀，离心5 min，弃上清，收集细胞，并计数。取1.5×105个/ml重悬的细胞，离心 5 min，弃上清，加入 500 μl结合液轻轻重悬细胞后，加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，再加入5 μl碘化丙啶，室温(20℃ ～25℃)避光孵育10 min后，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

1.4.3 透射电镜观察各组细胞的超微结构变化 以0.25%胰酶-0.02%EDTA联合消化液将各组细胞消化下来，离心后PBS洗涤3次，去除残留的EDTA，调整细胞密度至1×106个/ml，轻轻反复吹打均匀，800 r/min离心5 min后，以2.5%戊二醛前固定约2 h，0.1 mol/L PBS漂洗3次(10 min/次)，1%锇酸后固定1 h，0.1 mol/L PBS漂洗 3次(10 min/次)，丙酮逐级脱水(50%、70%、90%、100%)，丙酮与EPON812环氧树脂包埋剂1∶1比例浸泡→纯包埋剂浸泡→包埋→修块机修块定位→超薄切片机切片→醋酸铀与硝酸铅双重染色，最后日立H-7500透射电镜观察各组细胞超微结构变化。

2 结果

2.1 各组细胞活性MTS/PMS比色分析法测定结果 正常组细胞活性正常，良好生长(0.608±0.045);与正常组相比较，模型组细胞活性明显下降(0.324±0.051，P＜0.01);给予阿托品组、耳针组含药血清后，细胞活性较模型组细胞活性有明显改善(0.506±0.037，0.515±0.029，P＜0.01);但迷走神经切断组、六烃季铵组以及α-银环蛇毒素组大鼠血清后，其细胞活性仍明显低于正常组和耳针组(0.330±0.047、0.362±0.130、0.355±0.038，均P＜0.01)，且与模型组相比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 流式细胞仪检测各组细胞的凋亡或坏死情况 正常组细胞良好生长，细胞凋亡率较低，主要分布于左下象限;模型组细胞凋亡较多，分布于右上象限(Q2)和右下象限(Q4)细胞比例较正常组明显升高，差异显著(P＜0.01);而耳针组，阿托品组细胞凋亡率较模型组细胞显著减少(均P＜0.01);给予迷走神经切断组、六烃季铵组和α-银环蛇毒素组动物血清后，细胞凋亡率仍显著高于正常组和耳针组(均P＜0.05)，但与模型组间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率(%，s)

表1 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率(%，s)

与正常组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与模型组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01;与耳针组比较:5)P＜0.05，6)P＜0.01

10 9.28±0.84 5.30±0.65 85.33±1.33模型组 6 31.80±1.772) 37.88±3.372) 30.15±4.682)耳针组 8 22.33±1.662)4)29.90±3.022)4)47.63±4.282)4)阿托品组 8 22.55±1.032)4)32.13±4.132)4)47.08±3.682)4)迷走神经切断组 7 31.63±1.312)6)35.63±1.762)4)6)32.53±3.212)6)六烃季铵组 7 30.28±1.822)6)34.13±3.242)6)33.25±5.282)6)α-银环蛇毒素组 8 30.30±0.832)6)34.78±2.282)6)32.88±1.462)6)早期凋亡率 晚期凋亡率 存活率正常组组别 n

2.3 透射电镜观察各组内皮细胞的超微结构变化 正常组(A)内皮细胞结构正常，核仁清晰可见;模型组(B)接受造模条件培养液孵化培养后，损伤明显，可见细胞凋亡的标志凋亡小体;给予耳针组(C)或阿托品组(D)血清后，内皮细胞受高脂高糖损伤明显减小，耳针组可见到清晰的细胞微绒毛，说明细胞新陈代谢较为旺盛，生存状态较模型组有明显改善;而阿托品组细胞仅见到染色质加深而未见凋亡小体，说明细胞状态也较模型组良好;给予迷走神经切断组(E)血清后，细胞受损情况较模型组没有明显改善，细胞膜碎裂，核内物质向细胞外散失，已具凋亡细胞的特征;而给予六烃季铵组(F)血清后，细胞凋亡情况也较为明显，细胞核已碎裂为2部分，凋亡小体也可清晰可见，其细胞状态较模型组没有明显改善;α-银环蛇毒素组(G)细胞状态也较差，与模型组细胞类似，可见到明显的凋亡小体。

3 讨论

中医学认为耳与经络以及脏腑功能有着密切的联系，《灵枢·邪气脏腑病形篇》云:“十二经脉，三百六十五络，其气血皆上于面而走空窍，其精阳气上走于目而为睛，其别气走于耳而为听。”晚清医家张振鋆与其族弟张地山著有《厘正按摩要术》-书中则提出了耳背分属五脏的理论，指出“耳珠属肾，耳轮属脾，耳上轮属心，耳皮肉属肺，耳背玉楼属肝”等耳与五脏分属的生理联系。因此，正如《卫生宝鉴》指出的那样:“五脏六腑，十二经脉皆有络于耳者。”

本课题组以往研究显示，耳甲腔穴位胰胆电针刺激能影响孤束核葡萄糖敏感神经元以及胰岛素敏感神经元的自发性放电频率〔6〕;进一步采用逆行神经示踪法研究发现，耳甲腔迷走神经耳支末梢与孤束核以及迷走神经背核具有投射关联〔7〕，据此推测耳针作用机制可能与兴奋迷走神经有关。Tracy等〔8〕研究发现，迷走神经刺激或采用胆碱能激动剂可促使神经末梢释放乙酰胆碱并作用于炎性细胞表面的乙酰胆碱的N型受体α7亚单位(α7nAChR)，抑制炎症因子，如 IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α等及趋化因子合成和释放，从而降低或阻止局部或全身的炎症反应，这一机制被命名为“胆碱能抗炎通路”。前期研究显示，电针耳甲区穴位(有迷走神经耳支分布)可降低2型糖尿病模型大鼠循环血液中促炎因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α以及C-反应蛋白(CRP)的水平，并改善胰岛素抵抗指数，据此推测耳针刺激可能具有与迷走神经刺激相类似的胆碱能抗炎效应〔4〕。

本研究结果提示耳针血清对血管内皮细胞具有显著的保护作用。进一步实验发现胆碱能M受体阻断剂阿托品对耳针保护作用无影响，而N型AchR阻断剂六烃季铵组和N型AchR α7亚单位拮抗剂α-银环蛇毒素则则能够阻断耳针血清的保护效应。据此推测耳针效应可能是通过兴奋迷走神经，并促进乙酰胆碱的释放及与其AchR α7亚单位结合而介导的。这一结果与李建国等〔9〕针刺足三里激活胆碱能抗炎通路抗大鼠失血性休克的研究结果类似。

本文所采用的“针刺血清”的方法是受“血清药理学”和“中药血清学”的启发而提出的，该方法与以往在体实验检测针灸后的人或动物血清成分含量及其变化相比，可排除体内多因素的影响，获得了较为理想的结果，克服了在体实验的局限性〔10〕。然而，对于针刺血清来源、血清有效部位及其作用对象和作用途径等，学界尚未达成一致的共识，因此关于针刺血清实验方法尚待进一步规范与改进。

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