丹参酮ⅡA对兔动脉粥样硬化病灶凋亡相关基因表达的影响

沈晓君 高爱社 关怀敏 丁淑亚 赵君玫 陈 芳 (河南中医学院，河南 郑州 450008)

动脉粥样硬化(AS)的发病机制至今尚未完全阐明，目前的研究认为血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和迁移是AS的成因之一，因此，促进过度增殖的VSMC凋亡是逆转AS病变的有效途径。丹参酮ⅡA是丹参中有效的脂溶性药理成分之一，研究证实丹参酮ⅡA可抑制AS时VSMC过度增殖，对AS及其所致心脑血管疾病的治疗有很高的应用价值〔1〕，本实验通过差异显示筛选出与丹参酮ⅡA促进VSMC凋亡相关的葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因片段，观察该基因在兔正常及AS病变组织中的表达水平，探讨丹参酮ⅡA诱导VSMC凋亡可能的机制和作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 丹参酮ⅡA对照品购自中国药品生物制品鉴定所，20 mg/瓶，批号：200619。同型半胱氨酸，Sigma公司产品，25 g/瓶，纯度≥98%，批号：C-7352。兔主动脉VSMC由中国协和医科大学基础医学院细胞培养中心提供。雄性日本大耳白兔，体质量1.8～2.0 kg，普通级，5月龄，由河南省科学技术开发交流中心提供，质量合格证号：SCXK(豫2005-00027)。In si-tu Apoptosis Detection Kit，pMD-19T载体，DNA 连接酶，大肠杆菌JM109，限制性内切酶BamHⅠ，限制性内切酶HincⅡ，Taq酶(均为大连宝生物工程有限公司产品)，DMEM(Gibco BRL.USA产品)，高纯总RNA快速提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司产品)，逆转录试剂盒(Fermentas产品)，抗地高辛标记HRP检测试剂盒(北京中山生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法细胞增殖能力检测 细胞按1×108/L密度稀释后接种于96孔培养板培养24 h后分为空白组、HCY模型组、丹参酮ⅡA处理组，每组设6个复孔。除空白组外，各组均加入同型半胱氨酸，剂量为10－4mol/L，培养24 h后，丹参酮ⅡA处理组分别加入终浓度0.25、0.5、1 mg/L的丹参酮ⅡA，培养48 h后，加入 MTT(5 mg/ml)液 20 μl/孔，继续培养4 h，去上清，加入150 μl/孔二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，上酶标仪490 nm处测吸光度值。

1.2.2 RT-PCR 参照GenBank公布的GRP78基因cDNA序列，应用RRIMER PREMIER 5.0等分析软件进行分析后，设计两对引物。GRP78序列引物，上游：5-TCT AGG TGAACGACCCCTAAC-3，下游：5-GTTCTCTCAATTTTCTCCCAAC-3;β-actin引物设计，上游引物：5'-CTACAATGAGCTGGTGTGG-3'，下游引物：5'-TAGCTCTTCTTCAGGGAGGA-3'。提取每组细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，以β-actin为内参照，扩增GRP78基因，回收各组表达明显差异的基因片段，1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用Gel Doc200TM型凝胶图像分析仪进行吸光度扫描，观察条带的灰度强弱，结果以目的基因与β-actin的积分吸光度比值表示。

1.2.3 克隆差异表达基因片段、酶切鉴定并测序 PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的片段，琼脂糖凝胶回收，目的片段与质粒pMD19-T载体的重组连接、连接产物转化大肠杆菌JM109、感受态的制备和转化方法参照分子克隆第三版进行。取少许菌落，菌液PCR扩增，产物琼脂糖凝胶电泳分析，进行重组质粒的筛选，用限制性内切酶BamHⅠ单酶切，BamHⅠ和HincⅡ双酶切重组质粒pMD-19T-GRP，鉴定、测序。

1.2.4 复制AS动物模型 12只雄性日本大耳白兔，体质量1.8～2.2 kg，随机分为高脂组和正常组，每组6只。正常组饲喂普通饲料，高脂组在普通饲料中加入1%胆固醇及0.02%蛋氨酸，单笼喂养。饲喂9 w后，开胸快速截取胸主动脉上段，迅速至液氮罐中(-196℃)中保存。

1.2.5 制备地高辛标记探针 采用质粒提取纯化试剂盒进行质粒DNA小量制备及纯化，直接扩增目的基因片段，抗地高辛标记HRP检测试剂盒标记。在硝酸纤维素膜点样检测探针，放入80℃烤箱中固定2 h，放入15～25℃马来酸缓冲液中洗2 min，分别在阻断溶液、抗体溶液中轻摇30 min，用洗涤缓冲液洗2次，每次15 min，放入显色溶液中，暗处静置孵育30 min。条带出现后，TE缓冲液洗涤以终止反应。

1.2.6 组织原位杂交 兔胸主动脉常规脱水、浸蜡、包埋，切片厚度6～8 μm。使用1 μg/ml蛋白酶 K(0.1 mol/L Tris HCl缓冲液配制，pH8.0)，37℃孵育10 min，PBS洗涤，暴露 cDNA核酸片段。1%多聚甲醛后固定，预杂交。每张切片加20 μl探针杂交液，将原位杂交专用盖玻片保护膜盖在切片上，恒温箱中95℃ 10 min使DNA变性，38～42℃杂交过夜。洗涤，滴加蛋白封闭缓冲液，再滴加兔抗地高辛-BSA，37℃ 60 min，PBS洗涤。滴加HRP-羊抗兔 IgG，37℃ 30 min，PBS洗涤，DAB显色，苏木精复染，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

2 结果

2.1 丹参酮ⅡA对VSMC增殖能力的影响 与空白组相比较，模型组OD值显著升高(P＜0.01)，证明HCY可促进VSMC增殖，实验造模成功;与模型组相比，高、中、低浓度的丹参酮ⅡA都可抑制HCY所诱导的VSMC增殖(P＜0.05)，抑制作用与丹参酮ⅡA浓度呈正相关。见表1。

2.2 GRP78 mRNA表达 RT-PCR半定量检测显示丹参酮ⅡA处理组细胞GRP78 mRNA有明显表达，与模型组比较差异显著(P ＜0.05)，见表1。

2.3 差异表达基因片段测序结果 全长648 bp的基因片段与兔GRP78基因高度同源。

2.4 组织原位杂交 兔主动脉石蜡切片、HE染色见正常组血管内皮细胞完整，中膜VSMC排列整齐;高脂组血管内皮细胞脱落，中膜VSMC增生，并见大量胶原纤维形成，见图1。组织原位杂交高脂组与正常组主动脉VSMC胞质中均可见棕黄色颗粒表达，并有核周聚集现象，表明探针与VSMC胞质中的GRP78 mRNA结合。高脂组与正常组比较，聚集颗粒明显增多，表明高脂组家兔VSMC GRP78基因表达水平高于正常组，见图2。

表1 丹参酮ⅡA对兔VSMC增殖能力及GRP78 mRNA表达的影响( s ，n=6)

表1 丹参酮ⅡA对兔VSMC增殖能力及GRP78 mRNA表达的影响( s ，n=6)

与空白组比较：1)P＜0.01;与模型组比较：2)P＜0.05

－ 0.68±0.03 0.103±0.041模型组 10－4mol/L 0.89±0.061) 0.275±0.0351)丹参酮ⅡA 0.25 mg/L 0.78±0.042) 0.338±0.0332)0.5 mg/L 0.76±0.032) 0.349±0.0262)1 mg/L 0.75±0.052) 0.382±0.0292)-actin mRNA空白组组别 浓度 OD值(490 nm)GRP78mRNA/β

图1 兔主动脉组织切片(HE，×100)

图2 组织原位杂交检测主动脉VSMC GRP78 mRNA阳性表达信号(×100)

3 讨论

AS时动脉中膜的VSMC迁入内皮下间隙并增生，部分VSMC摄取脂质转化为肌源性泡沫细胞，与巨噬细胞源性泡沫细胞在动脉内膜聚集，形成脂质条纹等AS早期病变。VSMC还可由收缩型转化为合成型，产生大量细胞外基质组成纤维帽，纤维斑块中的泡沫细胞进一步坏死崩解，形成粥样斑块等AS典型病变。因此，抑制VSMC的增殖可能成为治疗动脉粥样硬化等心血管疾病的主要策略之一〔2〕。

近年来，内质网应激(ERS)在冠心病不稳定斑块形成中的重要作用受到广泛关注〔3〕。ERS作为细胞水平的应激将AS形成的细胞机制与多种危险因素联系起来，并贯穿于其发展的整个过程〔4，5〕。热休克蛋白(Hsp)是应激情况下细胞新合成或合成增加的一组蛋白质，从原核细胞到真核细胞的各种生物体，其同类型的Hsp基因序列有高度同源性，其功能涉及细胞的结构维持、更新、修复、免疫等，对于维持细胞生命具有重要意义。GRP78是Hsp70家族的成员之一，蛋白在内质网腔形成空间结构由许多分子伴侣蛋白协助，GRP78与新生多肽以非共价键形式短暂结合以促进蛋白质的正确折叠，是内质网中最重要的分子伴侣之一。GRP78在应激反应调节时其基因的转录活性可显著提高，被认为是ERS的一种标志蛋白〔6〕。GRP78的表达是细胞的一种适应性保护反应，但是随着应激反应的演进，过度的ERS可激活下游的凋亡信号分子，促使细胞发生凋亡，由此可见，ERS是存活程序和凋亡程序同时被激活的过程〔7〕。Croons等〔8〕对体外培养的VSMC给予嘌呤霉素后出现细胞凋亡，同时检测到内质网应激信号蛋白表达;给予内质网应激阻断剂放线菌酮可以部分减少VSMC凋亡，证明VSMC凋亡机制有RES的参与。

作为单体的丹参酮ⅡA具有抗心律失常、抗心肌肥厚和缺血，改善内皮功能等多种心脑血管系统药效作用。研究发现丹参酮ⅡA可通过下调钙调神经磷酸酶活性和抑制钙调神经磷酸酶mRNA表达、阻止大鼠VSMC细胞周期由G0/G1期向S期推进、引起细胞外信号调节激酶磷酸化活性降低，c-fos表达水平降低而抑制VSMC增殖〔9，10〕。近年来丹参酮ⅡA对心脏和血管影响的研究有了更深层次的发展，但其通过上调GRP78等内质网应激蛋白基因使凋亡信号放大，诱导过度增殖的VSMC凋亡的研究报道甚少。

本实验表明GRP78基因参与AS病变过程;该基因片段定位于VSMC胞质，提示ERS可能是AS时VSMC增殖失控的机制之一。本研究差异筛选出GRP78基因片段，组织原位杂交证实其来源于兔VSMC并与丹参酮ⅡA诱导的细胞凋亡有关，提示该基因可能是丹参酮ⅡA作用靶点之一。在丹参酮ⅡA诱导VSMC凋亡的同时GRP78基因高表达，提示过度的ERS促进VSMC凋亡。但丹参酮ⅡA调控GRP78表达、启动细胞凋亡的途径还有待于进一步的研究。

1 李 欣，杜俊蓉，白 波，等.丹参酮ⅡA抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖及其机制研究〔J〕.中国中药杂志，2008;33(17)：2146-50.

2 钟芝茵，周 喆，邢雅玲，等.丹参酮ⅡA、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1配伍对平滑肌细胞的抑制作用〔J〕.军事医学科学院院刊，2008;32(4)：340-3.

3 王 旭.内质网应激与动脉粥样硬化研究进展〔J〕.中国动脉硬化杂志，2009;17(4)：323-6.

4 Semion T，Tabas I.Mechanisms and consequences of macrophage apoptosis in atherosclerosis〔J〕.J Lipid Res，2009;50(Suppl)：382-7.

5 Dickhout JG，Colgan SM，Lhotak S，et al.Austin increased endoplasmic reticulum stress in atherosclerotic plaques associated with acute coronary syndrome：a balancing act between plaque stability and rupture〔J〕.Circulation，2007;116(11)：1214-6.

6 沈晓君，何 航.淫羊藿苷对HCY诱导增殖血管平滑肌细胞GRP78表达的影响〔J〕.中国中药杂志，2009;34(15)：1964-7.

7 杨丽霞，沈珠甫，郭瑞威，等.Bcl-2在神经酰胺致人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用〔J〕.中国动脉硬化杂志，2008;16(2)：132-5.

8 Croons V，Martinet W，Herman AG.Differential effect of the protein synthesis inhibitors puromycin and cycloheximide on vascular smooth muscle cell viability〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2008;325(3)：824-32.

9 潘勇军，李晓勇，杨光田.丹参酮ⅡA对增殖的大鼠血管平滑肌细胞中钙调神经磷酸酶活性的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2009;29(2)：133-5.

10 李 欣，杜俊蓉，白 波，等.丹参酮ⅡA抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖及其机制研究〔J〕.中国中药杂志，2008;33(17)：2146-50.