河南省汉族人群2型糖尿病患者PLIN基因rs2304796和rs894160位点的多态性*

李春阳，陈 冰，王娇峰，李艳艳，余大海，胡东生

1)郑州大学公共卫生学院毒理学教研室 郑州 450001 2)郑州大学公共卫生学院流行病学教研室 郑州 450001 3)深圳大学医学院 深圳 518060

2型糖尿病是严重威胁人类健康的主要慢性病之一。多项调查[1-5]显示1980年到2001年在中国成年人中其发病率由1.0% 上升至5.5%，2006年部分农村地区已达到6.72%。2型糖尿病是由遗传、环境等多种因素共同作用导致的多基因遗传性疾病，具有明显的家族遗传倾向。PLIN基因位于15q26.1，含有9个外显子，与已报道的肥胖、2型糖尿病、高脂血症的易感基因位置临近[6]。该研究旨在探讨PLIN基因rs2304796及rs894160位点多态性与河南汉族人群2型糖尿病发生的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象在河南省的某农村社区以村(组) 为单位，采用随机整群抽样的方法抽取18～80岁的汉族居民为研究对象。研究对象的纳入和排除标准见课题组[3]前期已发表的论文。调查时将调查内容告知所有调查对象，并签署知情同意书。

1.2现场调查采用横断面调查方法，调查内容包括问卷调查、人体测量、血压测量和血液生化检测。问卷调查内容、人体基本参数测定方法、血液生化指标测定方法及诊断标准的详细内容见课题组[3]前期已发表论文。

1.3多态性检测

1.3.1 引物设计 应用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，由上海英竣生物技术公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.3.2 rs2304796位点多态性检测 采用PCR-RFLP技术。PCR反应体系(25 μL)包括：10×Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)2.0 μL,引物混合物1 μL, DNA聚合酶(大连宝生物工程公司)0.2 μL, DNA模板2.0 μL(10 μg/L),ddH2O 17.3 μL。PCR反应条件：95 ℃ 10 min;95 ℃ 40 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min, 35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经限制性内切酶(MBI公司)酶切，20 g/L琼脂糖凝胶电泳，显示334、220和114 bp 3个片段为CT型，220和114 bp两个片段为CC型，334 bp一个片段为TT型。

1.3.3 rs894160位点多态性检测 应用荧光定量PCR技术。反应体系包括：10×Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgC121.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)1.5 μL,引物1 μL,DNA聚合酶0.3 μL, DNA模板2.0 μL(10 μg/L), 20×EvaGreen 0.625 μL,ddH2O补足反应体系至25 μL。PCR反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s, 40个循环；在72 ℃收集荧光信号。反应结束后，由软件自动分析、显示熔解曲线和扩增曲线，并显示Ct值和熔解温度Tm，与上游引物1和2相对应平行管的Ct值分别为Ct1、Ct2，根据ΔCt(ΔCt=|Ct1-Ct2|)值进行基因分型。ΔCt≤3为杂合子，ΔCt≥6为纯合子。上游引物1参与反应的荧光信号显著高于上游引物2参与反应的荧光信号为GG纯合子基因型；反之为AA纯合子基因型。质量控制：每次检测设置2个空白对照，以2个重复标本作为阳性对照；随机抽取5%样本进行盲法复测，检验结果一致率100%。

1.4统计学处理调查数据用EpiData 3.12软件进行平行双录入，并进行一致性检验。使用SAS 9.13处理数据。2型糖尿病患者和非患者基本特征的比较采用两独立样本t检验和χ2检验；应用Unphased 3.0.7软件构建单倍型；用logistic回归模型评估调整协变量后的基因型与2型糖尿病的关系，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1一般情况共调查1 274人，其中符合要求、资料完整的2型糖尿病患者161人，年龄19～79(55.6±11.5)岁，非患者1 113人，年龄18～79(50.0±13.7)岁。2型糖尿病患者与非患者的基本特征见表2。

表2 2型糖尿病患者和非患者基本特征 例(%)

*：部分数据缺失。

2.2 2组人群PLIN基因rs2304796、rs894160位点多态性检测结果rs2304796位点共检出CC、CT和TT 3种基因型，rs894160位点共检出GG、GA和AA 3种基因型。2组人群PLIN基因rs2304796、rs894160位点多态性分布特征比较见表3、4。

2.3 2组人群PLIN基因rs2304796、rs894160位点单倍型比较见表5。

表3 2组人群PLIN基因rs2304796位点多态性分布 例(%)

*:调整了年龄、性别、婚姻状况、文化程度、经济收入、肥胖、血脂测量指标等因素。

表4 2组人群PLIN基因rs894160位点多态性分布 例(%)

*：调整了年龄、性别、婚姻状况、文化程度、经济收入、肥胖、血脂测量指标等因素。

表5 2组人群PLIN单倍型频率的比较

*：调整了年龄、性别、婚姻状况、文化程度、经济收入、肥胖、血脂测量指标等。

3 讨论

人类PLIN基因编码产生Perilipin A、B、C、D4种亚型蛋白，其中Perilipin A含量最多，特异性表达于脂肪细胞和类固醇生成细胞中，调节脂肪细胞中甘油三酯的存储与分解[7-8]。研究[9-10]表明PLIN基因多态性与代谢综合征相关指标如肥胖有关联, 而该基因多态性与2型糖尿病关系研究较少。

PLIN多态基因型的分布频率存在种族和地域差异。据报道[9-12]，法国健康人群PLIN rs894160变异等位基因频率为29.37%，西班牙人为26.2%,美国白人为27.0%，新加坡华人为42.0%，新加坡马来西亚人为43.0%，新加坡印度人为31.0%。该研究结果显示，河南汉族非糖尿病人群中PLIN rs894160变异等位基因(A)频率为35.71%，PLIN rs2304796变异等位基因(T)频率为33.18%，高于现有对中国汉族人群研究报告的28.28%[13]。

Qi等[9]发现西班牙白人女性中PLIN rs2304796位点与血糖变化无关。该研究结果显示，河南汉族人群中PLIN基因rs2304796位点在显性模型中，CC和CT+TT基因型频率在2型糖尿病患者和非患者间差异有统计学意义。Logistic回归模型分析结果提示，在调整了年龄、性别、婚姻状况、文化程度、经济收入、肥胖、血脂测量指标等因素后，PLIN基因rs2304796位点与2型糖尿病发生存在关联，T携带者发生2型糖尿病的危险度是CC型携带者的0.670倍(95%CI为0.475～0.944)，CT和TT基因型可降低2型糖尿病发生的风险。Qi等[9]发现在西班牙白人女性中PLIN基因rs894160位点AA基因型与低血糖有关，而Wang等[14]研究表明台湾人群中携带PLIN基因rs894160位点AA基因型者患2型糖尿病风险较高。该研究结果显示，在河南汉族人群中虽然携带rs894160位点(GA+AA)基因型者患2型糖尿病风险是GG基因型的1.207倍，但95%CI为0.851～1.713，提示PLIN基因rs894160位点突变与2型糖尿病发生危险性无关。

总之，该研究结果提示PLIN基因rs2304796位点多态性在河南汉族人群2型糖尿病发生过程中可能具有重要作用。该研究非糖尿病患者存在混杂因素，因此研究具有一定局限性。此外，由于PLIN基因变异存在种族差异，作者仅选择一个地区的汉族人群，难免存在选择性偏倚，因此要确定PLIN基因多态性与2型糖尿病的关系，尚需继续搜集样本再研究。

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