高脂血症对大鼠脑组织MMP-2表达及新生血管的影响*

张振强，贾亚泉，宋军营，李澎涛，潘彦舒，王丛笑，吕欢欢

1)河南中医学院科技处 郑州 450008 2)北京中医药大学东直门医院中医内科重点实验室 北京 100029

高脂血症能够通过损伤内皮细胞，分泌炎症因子和生长因子，诱导单核细胞集聚、黏附于内皮细胞，并迁入内皮下间隙，引起T淋巴细胞的浸润，参与炎症与免疫过程。单核细胞集聚经多种受体介导，不断地摄取已经进入内膜发生氧化的脂质，形成单核细胞源性泡沫细胞；内皮细胞更新、增生并分泌生长因子，可激活动脉中膜平滑肌细胞,经内弹力膜的窗孔迁入内膜，并发生增生、转化、分泌细胞因子及合成细胞外基质，经其表面受体介导吞噬脂质，形成平滑肌源性泡沫细胞。在动脉粥样硬化病变过程中，小动脉内径狭窄甚至闭锁，脑组织可出现慢性缺血缺氧，机体能否通过血管新生的方式来代偿脑内的病理变化过程，从而实现脑保护作用，该实验将进行验证分析。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组健康雄性SPF级12周龄Wistar大鼠20只，体质量280～300 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2007-0001]，质量合格证号：0243109。实验动物采用随机数字表法分为正常对照组、高脂血症组，每组10只。

1.2主要仪器与试剂主要仪器：全自动生化分析仪(奥林巴斯，型号AU2700)；酶标仪(Thermo，型号MK3)；洗板机(Thermo，型号WELLWASH4MK2)；自动平衡离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司，型号TDZ5-WS)；DT300A型电子天平(上海医用激光仪器厂常熟分厂)。主要试剂：体积分数10%水合氯醛(武汉市和昌化工有限公司)；PBS缓冲液(上海富众生物科技发展有限公司)；基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、人白细胞分化抗原34(CD34)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)一抗、二抗及链霉菌素-过氧化物酶溶液(武汉博士德生物工程有限公司)；VEGF ELISA检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3高脂血症动物模型制备方法高脂血症组大鼠每天以高脂饲料[组成成分(质量分数)：3.5%胆固醇、10.0%猪油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠、5.0%白糖、80.8%基础饲料]喂养[1]，正常对照组以正常饲料喂养，4周后正常对照组与高脂血症组分别断尾取血0.5～1.0 mL检测血脂，高脂血症组血脂指标与正常对照组相比差异有统计学意义，则说明模型制备成功[2]，否则继续饲养。

1.4血脂检测模型制备成功后，每组各取动物5只，以体积分数10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，背位固定于鼠板上，腹主动脉取血5 mL，静置30 min，以3 000 r/min离心15 min，取上清液，-20 ℃冰箱冷冻备用。血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)用全自动生化分析仪进行检测。

1.5血清VEGF含量检测采用ELISA法检测血清中VEGF的含量，依照试剂盒说明书步骤进行操作。

1.6脑组织MMP-2、ICAM-1、CD34、VEGF免疫组化染色及HE染色每组各取动物5只，以体积分数10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，背位固定于鼠板上，剪开胸腔，暴露出心脏，先用手术剪剪开右心耳，再用100 mL注射器进入左心室插进主动脉，先灌注生理盐水150 mL左右，再灌注多聚甲醛400 mL左右，断头取出全脑，脑组织置于40 g/L多聚甲醛固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、冠状切片，片厚4 μm，制作常规病理切片，进行HE染色和免疫组化染色，在高倍镜(×400)下选取5个视野计数阳性细胞(棕黄色染色)，结果取平均值(个/mm2)。

1.7统计学处理应用SPSS 13.0进行统计学处理，2组血脂、血清VEGF含量及脑组织VEGF、MMP-2、 ICAM-1和CD34表达情况的比较均采用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组TC、TG、HDL-C、LDL-C检测结果见表1。

2.2 2组脑组织病理学观察结果见图1。与正常对照组相比，HE染色显示高脂血症组大鼠毛细血管增多；神经细胞较多，少量神经元固缩；星型胶质细胞增生较明显；细胞形态结构基本正常。免疫组化结果显示：高脂血症组大鼠脑组织内MMP-2主要表达在皮层及海马区；CD34阳性细胞增多，主要分布于新生毛细血管；VEGF和ICAM-1表达均增多。

2.3 2组血清VEGF含量及脑组织MMP-2、ICAM-1、CD34和VEGF表达结果见表2。

表1 2组血脂检测结果 mmol/L

图1 2组脑组织HE染色和免疫组化结果(×400)

表2 2组大鼠血清VEGF含量和脑组织MMP-2、ICAM-1、CD34、VEGF的表达

3 讨论

MMP-2主要由血管内皮细胞、星形胶质细胞、白细胞等合成和分泌，主要功能为降解细胞外基质，促使组织细胞的再生及迁移；正常情况下含量极少，但当有炎症反应时，在IL-1、IL-6、TNF-α、VEGF、PDGF等作用下，能够活化上述细胞。胞内线粒体和溶酶体增多，一方面起到吞噬细胞碎片和坏死组织作用，另一方面释放包括MMP-2在内的各种酶类，破坏基底膜的毛细血管内皮细胞的紧密连接，引起组织细胞的炎症性水肿[3-4]，所以MMP-2在脑组织的表达有双向性，既可损伤组织，又有清除与修复组织的作用[5-6]。该研究显示，高脂血症组大鼠脑组织内MMP-2表达比对照组增多，主要表达于皮层及海马区，但是没有发现脑细胞水肿及脑功能明显损害，推测MMP-2可能起到组织修复作用。由于高脂血症是一个慢性病变过程，MMP-2高表达可能是激活内源性保护的机制之一。

内皮功能障碍时，ICAM-1能够使血流中的单核细胞与血管内皮细胞黏附，进入内皮下基质集聚。有研究[7-10]证实，慢性缺氧时其黏附功能增强，可促使内皮细胞分化和迁移，参与血管生成。该研究结果显示高脂血症组大鼠脑组织ICAM-1表达增多，而CD34表达的增多提示了新生血管较多，ICAM-1可能参与了血管的生成。因为CD34是一种跨膜糖蛋白，有黏附、促血管前内皮细胞聚集并形成血管、调控造血细胞增殖和分化的功能[11-12]。

VEGF对血管形成有关键而且特异性作用，脑血管发生的主要方式是通过VEGF与血管内皮细胞上的2个酪氨酸激酶受体(VEGFR-1和VEGFR-2)结合启动血管新生的最初始过程——出芽，形成未成熟的血管[11]。VEGF主要生物学功能有：①促进微血管内皮细胞增殖、迁移。②增加微血管通透性，有助于再通血管，促进周围侧支循环建立。③通过改变内皮细胞的基因表达，产生蛋白水解酶，降解细胞外基质，促进生长的毛细血管向基质迁移。在炎症、缺氧等因素作用下，通过内皮细胞、炎症细胞、结缔组织等产生促使血管内皮细胞生长活性物质，在毛细血管和细静脉的基础上诱导新生血管的形成[7,13]。该研究结果显示，无论是大鼠血清中还是脑组织中VEGF的表达都是增加的，推测高脂血症对脑内血管生成具有一定影响，这可能是体内的一种内源性保护机制之一。

脑组织细胞在炎症因子、各种趋化因子等因素作用下，会发生一系列的病理反应，包括胶质细胞、内皮细胞、基质成分等结构和功能的改变，对神经元、神经纤维及神经突触造成影响。作者发现高脂血症组和正常对照组相比较，光镜下大脑皮质毛细血管增多，神经细胞少量固缩；胶质细胞数量增多，主要集中在小血管周围，形态结构基本正常。高脂血症可以损伤血管内皮细胞，引起动脉粥样硬化等病理变化，从而使脑组织出现相对的、慢性的缺血缺氧，机体对抗这种变化，启动内源性保护机制。该研究结果表明模型大鼠脑组织MMP-2表达及新生血管的变化，可能是高脂血症诱发机体脑组织内源性保护机制之一，其详细的作用机制尚需进一步深入研究。

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