后天感染河南樱桃谷鸭乙型肝炎病毒模型的建立*

臧利敏,吴学炜,赵雪杰,方先珍,杨晓瑞,王庆端,常俊标,郑立运#

1)郑州大学医药科学研究院药化室 郑州 450052 2)郑州安图绿科生物工程有限公司 郑州 450016 3)河南省动物疫病预防控制中心测报科 郑州 450008

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是当今人们面临的主要健康问题，全球约有4亿人为慢性乙型肝炎感染者[1]。HBV宿主范围狭窄，建立理想的HBV动物模型是有效筛选抗病毒药物、研究HBV感染机制和发病过程的基础[2]。鸭乙型肝炎病毒(duck hepatitis B virus, DHBV)是一种禽类嗜肝DNA病毒，其形态结构、基因组特征、生命周期、生物学特性等与HBV非常相似[3]。目前, DHBV模型已成为国内外认可的抗HBV药物体内活性筛选和评价的动物模型。国内已见报道的DHBV模型鸭主要有北京鸭、重庆麻鸭、广州樱桃谷鸭、湖北麻鸭等。通过雏鸭后天感染DHBV是建立模型的一个主要途径，但是鸭体内病毒血症持续的时间及水平受鸭种、毒种、产地、感染途径、感染剂量等多种因素影响，研究结果间存在一定差异。前期作者从河南本地樱桃谷鸭血清中分离并克隆了一株DHBV标准毒株。该研究中，作者采用DHBV阳性血清人工感染3日龄河南樱桃谷鸭，建立标准的人工感染河南樱桃谷鸭乙型肝炎动物疾病模型，探讨DHBV DNA在动物外周血和肝脏中的增殖规律，并观察抗病毒药物拉米夫定(3TC)鸭体内的抗病毒效用，验证该模型的科学性与实用性。

1 材料与方法

1.1动物与试剂1日龄河南省樱桃谷鸭120只，雌雄不拘，体质量(50±5) g，购买于河南省郑州市新郑宏达鸭业孵化公司；DHBV-WS病毒株(GenBank No:HM590411.1)由河南省医药科学研究院药化室分离和保存；DHBV标准质粒由河南省医药科学研究院药化室构建和保存；3TC为葛兰素史克苏州有限公司产品；SYBR Green Ⅰ染料购自宝生物工程(大连)有限公司；Viral DNA提取试剂盒和Tissue DNA提取试剂盒购自Omega Bio-Tek(美国)公司。

1.2引物的设计根据GenBank收录的DHBV S区核苷酸的保守序列设计引物，由北京博尚生物公司合成。上游序列：5’-CGGACAACGGGTCTACTAT-3’，下游序列：5’-GGTGGCAGAGGAGGAAGT-3’。

1.3DHBV阴性鸭的筛选1日龄河南樱桃谷鸭120只，经颈静脉无菌采血400 μL， 3 000 r/min离心5 min分离血清，酚/氯仿法提取DNA。PCR反应体系：10×Buffer 5 μL，10 μmol/L dNTP 4 μL，上、下游引物各0.5 μL，Taq酶0.5 μL、模板0.5 μL；反应条件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35个循环;72 ℃10 min。取PCR扩增产物在10 g/L 琼脂糖凝胶上进行电泳，155 bp处无条带判定为DHBV阴性鸭。

1.4DHBV模型鸭的建立1日龄DHBV阴性鸭48只，在3日龄时经胫静脉注射采用文献[3]方法得到的拷贝数为1.6×106mL-1的DHBV阳性血清0.20 mL，于第0、2、4、6、8、10、12、14、21、28、35、42天随机抽取，每次剖杀4只，分别按照Viral DNA提取试剂盒、Tissue DNA提取试剂盒说明书提取血清及肝脏DNA。

1.5荧光定量PCR检测采用郑州大学医药科学研究院药化室已建立的DHBV荧光定量PCR方法[4]检测血清和肝脏中DHBV DNA水平。 反应体系为20 μL： SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，上、下游引物各0.4 μL，H2O 7.2 μL；反应条件：95 ℃预变性1 min;95 ℃变性5 s，56 ℃退火5 s，72 ℃延伸25 s，共40 个循环；40 ℃冷却10 s。每个待测样本同时检测3管，取平均值。

1.6实验分组与处理另取1日龄DHBV阴性鸭48只，设正常组、模型组与3TC组各16只。模型组与3TC组鸭在3日龄时经胫静脉注射拷贝数为1.6×106mL-1的DHBV阳性血清0.20 mL。7 d后，正常组与模型组灌服生理盐水2 mL/(kg·d)，3TC组灌服3TC 20 mg/(kg·d)，共给药10 d。分别在给药5、10 d后及停药3 d后随机抽取，每次每组剖杀4只，按照试剂盒说明书提取血清及肝脏DNA，采用荧光定量PCR方法检测血清和肝脏中DHBV DNA水平。根据公式计算DHBV DNA抑制率，抑制率(%)=(模型组拷贝数-3TC组拷贝数)/模型组拷贝数×100%。

1.7肝脏病理学检查用药前、用药10 d后处死正常组、模型组和3TC组实验动物，后取肝左叶中部1.0 cm×1.0 cm大小肝组织固定于甲醛溶液，石蜡包埋、切片后HE染色，切片厚度为5 μm，光学显微镜下(×400)观察肝组织病变。

1.8统计学处理采用SPSS 13.0处理，不同组别不同时间点鸭血清和肝脏中DHBV DNA拷贝数的比较采用2×3析因设计的方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1DHBVDNA在模型鸭血清和肝脏中的增殖情况3日龄樱桃谷鸭经胫静脉接种DHBV阳性血清后，血清和肝脏中DHBV DNA水平的变化见图1。感染2 d后，48只雏鸭血清均可检测出DHBV DNA;在第2至14天，病毒量随着时间呈上升趋势，并于感染后第14天达到高峰，拷贝数达到7.7×109mL-1；第14至42天，血清DHBV DNA水平呈缓慢下降趋势；第6至42天，血清DHBV DNA拷贝数均维持在较高水平。肝组织中DHBV DNA含量的动态变化趋势与血清中基本一致。

图1 模型鸭血清和肝脏中DHBV DNA水平动态变化图

2.2模型组和3TC组鸭血清和肝脏DHBVDNA的水平模型组和3TC组鸭用药后血清和肝脏中DHBV DNA拷贝数比较结果见表1、2。3TC组在用药第10天，血清和肝脏DHBV DNA抑制率分别达到86.5%和84.9%；停药3 d后，DHBV DNA抑制率分别为79.7%和73.4%，即出现轻度的“反弹”现象。

表1 不同组别不同时间点鸭血清中DHBV DNA拷贝数(n=4)(×108 mL-1)

F组间=17.625，F时间=68.141，F交互=134.517，P<0.001。

表2 不同组别、不同时间点鸭肝脏中DHBV DNA拷贝数(n=4)(×108 mL-1)

F组间=69.430，F时间=35.330，F交互=75.770，P<0.001。

2.3各组鸭肝组织病理学观察结果见图2。正常组鸭肝细胞呈梭状，结构完整，轮廓清晰。用药前，模型组与3TC组肝组织部分细胞肿胀和出现空泡，汇管区可见炎细胞浸润及灶性坏死。模型组鸭肝脏在用药10 d后出现胞质疏松化、大量空泡、重度脂肪变性、水样变性和灶状坏死。与模型组相比，3TC组在用药10 d后病变细胞明显减少，炎症有很大程度减轻。

3 讨论

HBV具有明显的种属特异性，宿主范围狭窄。已报道[5]的HBV模型动物主要有黑猩猩、树鼩、土拨鼠、转基因小鼠、地松鼠、旱獭、鸭等。相比之下，鸭具有来源广、价格低、易于饲养、繁殖率高、重复性好等优点。目前国内用于筛选评价抗HBV药物的动物模型主要以DHBV模型为主。

DHBV模型建立的方法分为先天感染和后天感染两种。国内先天感染模型通常采用大批量筛选DHBV阳性鸭的方法[6-7]，所需样本量较大，一般选用自然感染率较高的品种。前期调查研究[3]发现，河南省樱桃谷鸭DHBV阳性率为8.1%，自然感染率较低，适宜建立后天感染模型。后天感染主要通过给1～3日龄雏鸭注射病毒阳性血清造成慢性携带状态。研究[8]表明，雏鸭体内免疫系统尚未成熟，容易形成免疫耐受，攻毒后病毒血症持续时间长且稳定。病毒血症的水平与所感染的 DHBV 毒株毒力强弱有很大的关系。该模型中病毒株的来源为河南樱桃谷鸭DHBV的一株分离株，其基因序列明确，易感性较高，经胫静脉注射后3日龄雏鸭感染率为100%。采用DHBV 1.6×106mL-1拷贝数阳性血清0.20 mL感染3日龄雏鸭，连续观察42 d，发现可维持较高的病毒血症而无明显的自然转阴现象, 具有良好的稳定性。其血清和肝脏中DHBV DNA分别在14、21 d达到高峰，在42 d内保持较高的水平。与邓学龙等[9]报道的广州樱桃谷鸭模型相比，病毒血症持续时间更长。胡权等[10]建立的湖北麻鸭乙肝模型，采用DHBV DNA重组质粒转染细胞上清感染雏鸭，第7天出现病毒血症，第11天达到峰值，第33天开始逐渐下降，与该研究结果也有一定差异。抗HBV药物筛选动物实验中，用药时间一般为10～15 d，该模型血清和肝脏中DHBV DNA 连续观察42 d均维持较高水平，能够满足实验需求。

图2 鸭肝组织病理切片(HE，×400)

该研究采用抗HBV药物3TC对模型进行验证，进一步证明了模型的可靠性。3TC是第一个用于治疗乙肝的经典核苷类药物，1999年在中国上市。该药物具有明确的药理作用，能够有效地抑制HBV DNA的复制[11]，改善肝组织病理状态。由实验结果可知，与模型组相比，3TC组鸭用药后血清和肝脏中不同时间的DHBV DNA拷贝数均有明显下降，在用药10 d后，血清和肝脏DHBV DNA抑制率分别达到86.5%和84.9%。而且可观察到用药10 d后3TC组鸭肝病理状态得到明显改善。因此，该模型可作为理想的DHBV后天感染疾病模型，为后期HBV的研究和抗HBV药物的筛选和评价奠定基础。

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