银木和樟树遗传多样性与亲缘关系的RAPD分析

柯艳妮,田良涛,陈永勤,王朴,杨之帆,陈桂桥

(1.湖北大学生命科学学院,湖北 武汉 430062;2.武汉市园林科学研究所,湖北 武汉 430081)

0 引言

樟树又名芳樟,为樟科樟属常绿阔叶乔木,是我国南方广为栽种的重要观赏园林树种,常用作行道树,在夏季有很好的遮荫、降温作用[1].同时,它也是一种重要的经济树种,是提取樟脑、芳樟醇、黄樟油素、桉叶油素、松油醇等精油的主要原料[2-3].

银木也为樟科樟属常绿阔叶乔木[1],与樟树形态非常相似,但叶片比樟叶大,故又名大叶樟.银木生长速度较快,成年树高可达25 m,胸径1.5 m,冠大荫浓,树姿雄伟,且叶片正面为绿色,背面为银白色,风吹叶动时树冠绿白闪烁,景色优美,具有很好的观赏性和园林利用价值.但银木在园林上的应用远不如樟树普遍,主要原因是担心其耐低温性能不强.30年前武汉市园林科学研究所从四川引种了少量银木,长期观察发现,银木在武汉市生长良好,且没有樟树容易出现叶片黄化的现象,经受了几个较强低温冬季的考验.特别是在2008年初百年一遇的低温暴雪天气(20天日平均温度在0 ℃以下,最低温度接近零下10 ℃)期间,银木表现出比樟树更强的抗寒性[4],说明银木在长江中下游地区生长是安全的,具有良好的应用前景[5].

随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphism DNA,RAPD)技术是用短的寡核苷酸随机序列作为引物进行PCR反应、扩增获得长度不同的多态性DNA片段,这些多态性DNA片段可以灵敏地反映不同个体之间的遗传差异.樟树作为我国重要的芳香油生产树种和园林绿化树种,人们对其进行了遗传多样性研究[6-9].本研究用RAPD技术分析并比较了银木和樟树这两种重要樟科植物间的遗传多样性与亲缘关系.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 银木(Cinnamomumseptentrionale)植株(7株,S1～S7)为武汉市园林科学研究所从四川引种,栽种于武汉市园林科学研究所;樟树(Cinnamomumcaphora)为生长于湖北大学校园内的芳樟,随机选择7株(C1～C7).

1.1.2 设备与试剂 DNA扩增仪为德国Whatman Biometra公司生产的Tpersonal PCR仪.用于RAPD扩增反应的50个随机引物购自北京奥科生物技术责任有限公司,每个引物长度为10 bp.用于PCR反应的Taq酶和其他试剂购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa).

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 取银木和樟树幼嫩枝条,装于塑料袋中带回实验室.取大约1 g幼嫩叶片,液氮冷冻、迅速研磨成粉末,并转移至预冷的离心管中,用改良的CTAB法[10]提取基因组DNA.

1.2.2 RAPD-PCR及电泳 反应体系为20 μL,含有1×buffer、DNA模板30 ng、2.0 mmol/L MgCl2、0.2 μmol/L引物、150 μmol/L dNTP和1.0 U Taq酶.

扩增程序为94 ℃预变性5 min,然后40个循环(94 ℃变性30 s,37 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s),最后72 ℃延伸10 min,4 ℃下保存.

扩增结束后,PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像系统中观察谱带,并照相保存.

1.2.3 数据处理和分析 每个反应重复2～3次.根据凝胶统计扩增的条带数,每个条带看作一个遗传位点,在相同迁移位置有带记为1,无带记为0.用Nei-Li相似系数法[11]计算出供试材料间遗传相似性系数,通过NTsys软件用UPGMA法对其进行聚类分析和构建聚类树状图.

2 结果与分析

2.1引物的筛选与多态性分析以3份银木和3份樟树的基因组DNA为模板,按设定的反应条件和程序用50个引物分别对其进行PCR扩增,根据凝胶电泳的结果,从中选出12个引物对所有的样品进行扩增.入选引物的条件为:空白对照扩增无带,样品有带,且条带清晰、不弥散.

用12个引物对7个银木和7个樟树样品进行扩增,共得91条带,其中多态性条带为48条,多态性条带百分率为52.7%;每个引物检测到的条带数介于4～11条之间,扩增片断长度大约在350～2 300 bp之间(表1).图1为引物编号为S187对供试材料扩增的电泳图.

表1 用于银木与樟树RAPD分析的随机引物及其扩增结果

图1 引物编号为S187对银木和樟树RAPD-PCR扩增的结果S1～S7:银木植株;C1～C7:樟树植株;M:DS 5 000 marker

2.2银木与樟树的遗传相似性分析遗传相似系数的大小反映了物种间或物种内个体间遗传差异的大小和亲缘关系的远近.对RAPD扩增结果利用Nei-Li方法计算得到银木和樟树种内及种间的遗传相似系数,结果总结于表2.从表2可知,银木植株间的遗传相似系数最低为0.457、最高为0.781,平均为0.564;而樟树植株间相应的遗传相似系数比银木的高,其最低值为0.646、最高值为0.862,平均为0.777,这说明银木个体间的遗传差异比樟树个体间的遗传差异要大.

银木植株与樟树植株之间的遗传相似系数在0.318～0.531之间,平均为0.422,明显低于这两种植物个体间相应的遗传相似系数(表2),说明银木和樟树有一定的遗传相似性,但彼此间的亲缘关系小于同种植物个体间的亲缘关系.

表2 银木与樟树的遗传相似系数比较

2.3银木与樟树亲缘关系的聚类分析聚类分析结果(图2)显示, 在距离系数0.215处,银木和樟树各聚为一类,说明两者之间存在较大的遗传差异.随着距离系数的缩小,两种植物的不同植株被进一步分成小类.与樟树相比,银木植株产生相同等级分类的距离系数要比樟树大(图2),这也说明了银木植株间的遗传差异比樟树植株间的遗传差异要大.

3 讨论

RAPD技术是利用短的随机引物检测生物种群中同源序列的一种分子标记技术,具有简便、快速和灵敏度高等优点,已广泛应用于植物种群划分、种群或个体间的遗传多样性和亲缘关系分析、遗传图谱构建、基因定位等研究领域[12].由于RAPD灵敏度高,使用合适的引物对于获得正确结果非常重要.在本研究中,根据RAPD结果计算得到的遗传相似系数(表2)显示了银木与樟树之间存在一定的遗传相似性,但两种植物间的遗传相似性低于同种植物个体间的遗传相似性;根据RAPD结果进行的聚类分析正确地把银木植株和樟树植株分成了两大类(图2),说明银木植株与樟树植株存在较大的遗传差异.这些在DNA水平得到的结果符合传统植物分类学的一般规律,说明所筛选出的12条随机引物适合于樟树与银木的RAPD分析.

图2 银木和樟树的聚类分析图S1～S7:银木植株;C1～C7:樟树植株

宋爱云等[7]、张国防等[8]和邢建宏等[9]用RAPD技术分析了生长于福建的芳樟、脑樟、桉樟和黄樟等不同化学类型樟树的遗传差异,均发现同类型樟树个体之间的遗传相似性比较高,遗传相似系数在0.5～1.0之间.张国防等[8]测得芳樟植株间的遗传相似系数在0.525～1.000之间,邢建宏等[9]的结果为0.601～0.854.本研究分析了生长于武汉的芳樟植株间的遗传差异,发现其遗传相似性也比较高,遗传相似系数在0.646～0.862之间,与已有的结果相吻合.

在本研究中,遗传相似性和聚类分析的结果都显示了银木植株间的遗传差异大于樟树植株间的遗传差异.这很可能是由于樟树人工栽培历史悠久,在长期的育种、繁殖与栽培过程中,其遗传物质交流比较频繁,因而个体间的遗传多样性变小;而银木尚未大规模栽培,大都为自然植株,故植株间的遗传多样性仍然比较大.

[1] 中国科学院植物志编委会.中国植物志-樟科(第31卷)[M].北京:科学出版社,1982:172-223.

[2] 程必强,喻学俭,丁靖垲,等.中国樟属植物资源及其芳香成分[M].昆明:云南科学技术出版社,1997:3-6.

[3] 李飞.中国樟树精油资源与开发利用[M].北京:中国林业出版社,2000:36-56.

[4] 王朴,金晶,陈桂桥,等.银木在园林景观设计中的应用[J].河北农业科学,2011,15(6):27-28.

[5] 王朴,陈桂桥,邱自桢,等.银木引种及栽培技术[J].中国园艺文摘,2012,28(4):125-125.

[6] 张国防,陈存及,邢建宏.樟树RAPD反应体系的优化[J].江西农业大学学报,2006,28(3):373-376.

[7] 宋爱云,陈辉,董林水.RAPD分子标记在鉴定香樟优选株和普通株中的应用[J].应用与环境生物学报,2003,9(3):263-265.

[8] 张国防,陈存及.不同化学型樟树的RAPD分析[J].植物资源与环境学报,2007,16(2):17-21.

[9] 邢建宏,刘希华,陈存及,等.樟树几种生化类型及近缘种的RAPD分析[J].三明学院学报,2007,24(4):433-437.

[10] Doyle J J, Doyle J L. Isolation of plant DNA from fresh tissue[J]. Focus,1990,12(1):13-15.

[11] Nei M, Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proceeding of the National Academy of Sciences of the USA,1979,76(10):5269-5273.

[12] 刘雄伦.RAPD技术在植物遗传育种上的应用[J].生物工程进展,2000,20(5):21-25.