小溪国家级自然保护区落叶木莲生长与遗传多样性分析

詹 鹏，徐万吉，陈介南*，张 林，谭亦文，石 旺

(1.国家林业局生物乙醇研究中心， 湖南 长沙 410004； 2.中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所， 湖南 长沙 410004； 3. 湖南小溪国家级自然保护区管理局， 湖南 永顺 416709)

小溪国家级自然保护区落叶木莲生长与遗传多样性分析

詹 鹏1,2，徐万吉3，陈介南1,2*，张 林1,2，谭亦文1,2，石 旺1,2

(1.国家林业局生物乙醇研究中心， 湖南 长沙 410004； 2.中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所， 湖南 长沙 410004； 3. 湖南小溪国家级自然保护区管理局， 湖南 永顺 416709)

对小溪国家级自然保护区内落叶木莲生长特性进行了调查，并采用RAPD-PCR分子生物学技术分析落叶木莲的遗传多样性。结果表明：该保护区内落叶木莲的胸径-树高生长曲线为Y=-0.0043X2+0.731X+0.7837；从UPGMA聚类基因图谱分析得出该区内落叶木莲具有遗传亲缘关系，推断该区内落叶木莲具有相近的起源，为研究该区内落叶木莲的起源及保护提供了科学依据。

落叶木莲；生长曲线；遗传多样性；小溪国家级自然保护区

落叶木莲(Manglietiadeciduas)又名华木莲，是我国特有单种属，1999年被列入《国家重点保护野生植物名录(第一批)》。由于其落叶的固有特性，落叶木莲为木兰科的木莲属与木兰属间的亲缘关系找到了一条纽带，对研究木兰科的系统演化，乃至探讨被子植物的起源，有着极其重要的地位[1]。另外，落叶木莲具有较高的观赏价值，可作为优美的庭园绿化树种、营造速生丰产林的树种和上等的建筑、家具、细木工等的用材树种。

2003年，小溪国家级自然保护区管理站在其核心区鲁家村收集植物资源种子时发现一种木莲属的种子，经有关专家实地考察，经鉴定该物种为落叶木莲。同年，在与鲁家村接壤的云盘村也发现了该树种，至此，打破了落叶木莲仅发布于江西幕阜山地宜春市明月山的报道[2-3]，使得落叶木莲成为湖南省拥有的珍稀国家重点保护野生植物。由于落叶木莲自身遗传多样性较差，其繁衍能力远远低于其它林木，使得落叶木莲种群数量稀少[4-5]，同时受群落内其他物种的竞争作用，加剧了落叶木莲的濒危程度[6]，对落叶木莲的调查及保护显得尤其重要。

随机扩增多态性(Random amplified poIymorphic DNA，RAPD)分子标记技术是建立在PCR基础之上检测受试材料基因组的遗传变异关系的一种分子生物学技术，由于其简便快捷、多态性高、成本低等特点，已在植物研究中获得了广泛应用，如进行植物遗传图谱的建立，植物系统分类学及种质资源遗传关系的研究，辅助选择育种等[7]。我们对小溪国家级自然保护区内落叶木莲的分布及生长特性进行了调查，并采用RAPD-PCR分子生物学技术揭示种间的亲缘关系，为保护这一珍稀濒危物种提供基础数据。

1 试验地概况

小溪国家级自然保护区位于湖南省西北部湘西自治州永顺县境内，地理坐标为：110°06′50″—110°21′35″E，28°42′15″—28°53′15″N。东西长23.5km，南北宽20km，总面积24800hm2，系亚热带保存最完整、面积最大的低海拔常绿阔叶原始次生林区之一，是少数免遭第四纪冰川侵袭而幸存的天然资源宝库之一。境内最高海拔1327.1m，最低海拔162.6m，海拔高度差达1164.5m。保护区属亚热带湿润季风气候，年平均气温12～14℃，无霜期海拔较低处为250d，800m以上为200d。年降水量1300～1400mm。土壤为板页岩发育的山地黄红壤，较肥沃，pH 值平均为 6.0。采样地位于小溪国家级自然保护区核心区鲁家村低塔，东经110°15′46.42″—110°15′48.56″，北纬28°51′47.00″—28°51′51.51″，海拔679～752m，总面积10000m2。

保护区内最大株落叶木莲位于鲁家村低塔，胸径70cm，树高31.2m，冠幅13m×12m，枝下高6m，主干高2m处已空腐，树龄约300a，年可采落叶木莲果实约20kg。该树10m×10m内土壤为山地黄红壤，pH 值为5.8，地表10cm处土壤密度为1.613g/cm3，有机碳质量为8.34g/kg，分布有宜昌润楠、甜槠、杨桐、锥栗、赤皮青冈、枫香、多青冈、线叶蕗蕨、钟鄂木(国家一级保护树种)、波叶木巴戟、尖连蕊茶、银木荷等物种。该树超过江西省宜春市明月山国家森林公园发现的树高30m、胸径63cm、冠幅7m×4m落叶木莲最大株的记录[1]。

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1 试验材料 落叶木莲树叶采自小溪国家级自然保护区核心区鲁家村，采集株数4株，置于封口袋内冰盒保鲜送至实验室，-80℃保存备用。样品情况详见表1。

表1 落叶木莲样品基本情况Tab1 BasicsituationofdifferentManglietiadeciduassamples编号胸径(cm)树高(m)经纬度海拔(m)经度纬度128158110°15′4856″28°51′4700″7522635110°15′4757″28°51′4919″706370312110°15′4605″28°51′5138″71241080110°15′4642″28°51′5151″679

2.1.2 试验试剂及引物 试验所需试剂均为市售分析纯。扩增所需引物由上海宝生生物科技有限责任公司设计合成(见表2)。

表2 引物序列Tab2 Sequenceofprimers序号引物名称引物序列 GC含量(%)1S365’AGCCAGCGAA3’602S375’GACCGCTTGT3’603S435’GTCGCCGTCA3’704S1345’TGCTGCAGGT3’605S1475’AGATGCAGCC3’606S3875’AGGCGGGAAC3’707S4045’GGCGGCTGTC3’808S4055’GGGAACGTGT3’60

2.2方法

2.2.1 生长曲线的测定 于2012年7月中旬进入保护区鲁家村进行落叶木莲的实地测定。其中树高采用测树仪法；胸径采用测树围尺法；经纬度采用GPS仪测定法。

2.2.2 遗传多样性分析

(1) DNA提取与检测。落叶木莲总DNA的提取采用如下方法[8]: ①去离子水将落叶木莲叶片洗净，灭菌后的吸水纸吸去表面的水分；②取0.2～ 0.3g 剪碎，加液氮迅速在研钵中研磨至粉状，加1.5 mL 65℃预热的CTAB 提取液；③分装至1.5 mL离心管中，65℃水浴60min；④加0.5 mL氯仿/异戊醇(24∶1，V/V)，混匀，8000r/min离心10min，取上清液，重复2次；⑤加2/3体积预冷的异丙醇，混匀，10000r/min离心10min，弃上清，70%乙醇洗涤沉淀；⑥干燥后50μL TE 缓冲液溶解沉淀，并加入2 μL 10mg/mL的RNAse室温放置30min，4℃保存备用。0.8%琼脂糖凝胶电泳，Syngene Genesnap凝胶成像系统观察拍照。

(2) RAPD-RCR扩增。PCR反应体系：25μL总体积，2.5μL PCR Buffer，0.2mMdNTP， 2.8 mM MgCl2，0.3 μM引物，2.5 U Taq DNA，100 ng DNA 模板。扩增程序为：94℃预变性4min，然后40个循环，每个循环中94℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min。反应在MJ PTC-200基因扩增仪上进行。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，Syngene Genesnap自动凝胶成像系统拍照观察。

3 结果与分析

3.1落叶木莲生长曲线

调查区域内落叶木莲胸径最小、最大值分别为6cm和70cm，树高最小、最大值分别为3.5m和31.2m，胸径在15cm以下的样本占总数(4株)的66.7%。通过Excel软件进行拟合，调查区域内落叶木莲胸径与树高存在着一定的相关性(R2=0.9693)，其公式为：Y=-0.0043X2+0.731X+0.7837，其中Y代表树高(m)，X代表胸径(cm)(见图1)。

图1 落叶木莲胸径-树高曲线Fig.1 Relationship between DBH and height of Manglietia deciduas

3.2RAPD-PCR检测

3.2.1 DNA质量检测 环境样品能否顺利提取基因组总DNA片段是能否进行RAPD-PCR技术分析的前提。所提取的DNA 样品的色泽为白色或近白色，采用核酸和蛋白质含量测定仪(GeneQuant Pro)检测 260nm、 280nm波长处的光吸收比值 OD260/ OD280为 1.75， 计算可知 DNA 产率为0.314ug/L，DNA 琼脂糖电泳图谱如图2所示。由图2可看出，各落叶木莲样品基因组 DNA 电泳得到的条带可进行后续RAPD-PCR分析。

图2 落叶木莲总DNA电泳检测Fig.2 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA of different samples

3.2.2 RAPD-PCR扩增 如表3所示，由于落叶木莲的遗传多样性较差，采用8种单引物对各落叶木莲DNA样品进行RAPD扩增所得图谱中的条带较少(0～4条)。通过比选扩增出条带的多少，选择引物S404(5’GGCGGCTGTC3’)为进行RAPD扩增的最优引物，并采用该引物对各落叶木莲样品进行扩增，以揭示各样本之间的亲缘关系。由图3可知，各样品均扩增出3至4个条带。1、3号样有3条条带，2、4号样有4条条带。

表3 引物扩增结果Tab3 Resultsoftheprimersamplification序号引物名称引物序列GC含量(%)条带数1S365’AGCCAGCGAA3’6012S375’GACCGCTTGT3’6043S435’GTCGCCGTCA3’7024S1345’TGCTGCAGGT3’6005S1475’AGATGCAGCC3’6026S3875’AGGCGGGAAC3’7007S4045’GGCGGCTGTC3’8018S4055’GGGAACGTGT3’603

图3 落叶木莲RAPD-PCR电泳检测Fig.3 Agarose gel electrophoresis of RAPD-PCR products

3.3聚类分析

通过DPS软件进行UPGMA聚类分析(见图4)，4个样品可分为2类，其中1、3号样分为1类，2、4号样分为1类，结合表1各落叶木莲的生长地域可推测1、3号落叶木莲可能是2、4号落叶木莲的后代，4株落叶木莲存在着亲缘关系。

图4 落叶木莲RAPD 的UPGMA聚类分析Fig.4 UPGMA cluster analysis of different samples

4 结论与讨论

通过实地测量确定了小溪国家级自然保护区内落叶木莲的胸径-树高生长曲线为Y=-0.0043X2+0.731X+0.7837，其中该区内最大株落叶木莲是迄今为止已有报道的最大株落叶木莲。通过RAPD-PCR分子生物学技术分析落叶木莲DNA，得出该区内落叶木莲具有遗传亲缘关系，为落叶木莲的起源研究及保护提供了科学依据 。

[1] 郑庆衍, 郑峻嵘.新发现的濒危树种——落叶木莲[J].植物杂志,2000(1):1.

[2] 易宏, 侯伯鑫, 陈家法, 等. 永顺县落叶木莲花的形态学研究[J].湖南农业大学学报：自然科学版. 2006,32(6):611-615.

[3] 侯伯鑫, 林峰, 田学洲, 等. 湖南永顺县落叶木莲资源考察研究[J].中国野生植物资源,2007,26(2):18-22.

[4] 廖文芳, 夏念和, 邓云飞,等.华木莲的遗传多样性研究[J].云南植物研究.2004,26(1):58-64.

[5] Hamrick JL, Godt MJW. Allozyme diversity in plant species[M]//Brown AHD, Clegg MT, Kahler AL, et al. Plant population genetics, breeding, and genetic resources.Sunderland, Mass:Sinauer Associates,1990:43-63.

[6] 袁斌荣. 落叶木莲的濒危机理与保护对策[J].江西林业科技,2005(3):45-46.

[7] 胡裕清, 赵树进.RAPD技术及其在植物研究中的应用[J].生物技术通报,2010(5):74-77.

[8] 邹喻苹, 葛颂, 王晓东.系统与进化植物学中的分子标记[M]. 北京:科学出版社, 2001.

(文字编校：张 珉)

AnalysisofgrowthandgeneticdiversityofManglietiadeciduasinXiaoxiNationalNatureReserve

ZHAN Peng1,2, XU Wanji3, CHEN Jienan1,2*, ZHANG Lin1,2,TAN Yiwen1,2, SHI Wang1,2

(1. State Bureau of Forestry, Bioethanol Research Center, Changsha 410004, China; 2. Institute of Biological and Environmental Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China; 3. Administration of Xiaoxi National Nature Reserve, Yongshun 416709, China)

The growth characteristic ofManglietiadeciduasin Xiaoxi National Nature Reserve was investigated, and the RAPD-PCR molecular biology technique and UPGMA cluster method were used to analyze the genetic diversity ofManglietiadeciduas. The results showed that, the DBH-height growth curve ofManglietiadeciduaswas fitted with a formula, which wasY=-0.004 3X2+0.731X+0.783 7. There were some genetic relationship and the similar origin among differentManglietiadeciduasplants in the survey area, which provided the scientific basis for the origin and protection ofManglietiadeciduasin Xiaoxi National Nature Reserve.

Manglietiadeciduas; growth curve; genetic diversity; Xiaoxi National Nature Reserve

2012-10-12

2013-01-11

国家林业局野生植物保护管理项目(090630)。

詹 鹏(1982-)，男，湖南省保靖县人，讲师，主要从事环境生物技术研究。

* 为通迅作者

Q 943

A

1003-5710(2013)01-0057-04

10. 3969/j. issn. 1003-5710. 2013. 01. 016