利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术检测痰标本中结核分枝杆菌及其耐药性的研究

张治国 欧喜超 孙倩 杜春英 高铁杰 赵雁林

我国是全球结核病高负担国家之一，结核病患者数居世界第二位［1］。目前我国常规应用的结核病实验室诊断方法如涂片显微镜检查敏感度较低，虽然固体培养具有较高的敏感度但是至少需要3～8周的时间，耗时较长［2］。用于检测Mtb的核酸扩增实验在速度上较传统培养方法具有明显的优势，但目前商品化的核酸扩增检测流程比较复杂，需要高精度设备、强大的技术支持和训练有素的工作人员，不太适合在大多数资源有限的结核病高负担国家应用。

利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（Xpert Mtb／RIF）整合了基于定量PCR分子遗传检测所需的3个步骤（样品准备、扩增、检测），将待检样品放入到Xpert Mtb／RIF反应盒中，系统就会自动按照相应的程序运行，实时监测PCR运行情况，一旦PCR完成，Xpert Mtb／RIF检测系统全自动化的软件就会判断出患者是否患有结核病，以及是否对利福平耐药［3］。本研究通过用该方法检测588例结核病患者痰标本，研究该技术诊断结核分枝杆菌（Xpert Mtb）及利福平耐药（Xpert RIF）的敏感度和特异度，探讨其在基层实验室的应用前景。

资料和方法

一、实验材料

试剂：Xpert Mtb／RIF Kit（Cepheid，USA），SR（sample reagent）（Cepheid，USA），分枝杆菌涂片镜检染色液和培养基均来自珠海贝索生物技术有限公司。

二、对象和方法

（一）研究对象

自2010年10月至2011年12月，连续纳入588例来昌平区结核病防治所就诊的具有肺结核可疑症状的初诊患者，收集患者痰标本分别进行涂片、培养和Xpert Mtb／RIF检测。其中涂阳338例、涂阴250例。338例涂阳患者中7例Xpert Mtb检测结果为错误，6例无效，3例Xpert RIF结果为无法判断；250例涂阴患者中9例Xpert Mtb结果为错误，34例无效，2例Xpert RIF结果为无法判断。最终可进行Xpert Mtb比对分析的患者为527例；527例患者中痰培养阳性363例，17例无Xpert RIF结果，最终可进行Xpert RIF比对分析的患者为346例。

（二）研究方法

对所有入选标本同时做涂片、罗氏固体培养、比例法药敏试验和Xpert Mtb／RIF检测。

1．痰涂片检查：痰涂片检查遵照文献［4］中的标准化操作程序执行。

2．分离培养：吸取2ml痰标本至带螺旋盖的前处理管中，视样本性状，加入1～2倍体积4%氢氧化钠前处理液，置涡旋振荡器上振荡30～60s至标本充分混匀，室温放置15min。前处理完成后，以无菌吸管吸取前处理液0．1ml，均匀接种在2支酸性罗氏培养基斜面上，保持斜面水平向上37℃培养24h后，直立放置37℃继续培养。接种后第3、7天观察培养情况，此后每周观察1次，并在分离培养结果记录本上记录生长结果［5］。

3．比例法药敏：用接种环取一环培养基上的菌落，研磨后与标准麦氏管比对制成1mg／ml菌悬液，梯度稀释为10-2mg／ml和10-4mg／ml，接种到含利福平（40μg／ml）的罗氏固体培养基和空白对照管培养基，37℃培养4周，观察结果［5］。

4．Xpert Mtb／RIF核酸扩增检测：取1ml痰标本置放到有螺旋盖的前处理管中，然后加入相当于2倍痰标本体积的SR痰标本处理液，旋紧前处理管，在涡旋振荡器上涡旋振荡15～30s，室温静置15min，使痰标本充分液化。打开反应盒，取2ml处理后样品由加样孔缓慢加入反应盒，然后将反应盒放置到检测模块，仪器开始进行自动化检测。反应结束后，在检测系统窗口下可直接观察测试结果。

三、统计学分析

采用SPSS 13．0对Xpert Mtb／RIF检测和检测金标准进行一致性检验（Kappa检验），Kappa≥0．75认为两者一致性较好

结 果

一、Xpert Mtb／RIF对痰标本Mtb的检测

使用Xpert Mtb／RIF检测527例就诊患者是否为结核病患者，其中涂阳322例，涂阴205例。与传统固体培养试验结果进行比较，结果见表1。

SPSS 13．0统计结果显示，以固体培养结果为金标准，Xpert Mtb／RIF检测涂阳患者Mtb的敏感度为98．1%（309／315）、特异度为14．3%（1／7）；检测涂阴患者 Mtb的敏感度为75．0%（36／48）、特异度为93．0%（146／157）；全部患者检测的敏感度为95．0%（345／363）、特异度为89．6%（147／164）。对Xpert Mtb／RIF和固体培养进行Kappa检验，K＝0．845，两者具有较好的一致性。

二、Xpert Mtb／RIF检测痰标本中Mtb对利福平的耐药性分析

使用Xpert Mtb／RIF方法检测346例患者痰标本中的Mtb对利福平的耐药性，其中涂阳309例，涂阴37例。与比例法药敏结果进行比较，结果见表2。

SPSS 13．0统计结果显示，以比例法药敏结果为金标准，Xpert Mtb／RIF方法检测涂阳患者利福平耐 药 的 敏 感 度 为 91．0% （39／43）、特 异 度 为96．6%（257／266）；检测涂阴患者利福平耐药的敏感度为66．7%（2／3）、特异度为94．1%（32／34）；全部患者检测的敏感度为89．1%（41／46）、特异度为96．3%（289／300）。对Xpert Mtb／RIF和比例法药敏进行Kappa一致性比较，K＝0．810，两者具有较好的一致性。

表1 Xpert Mtb／RIF检测Mtb效能分析（以固体培养试验为金标准）

表2 Xpert Mtb／RIF检测痰标本中的Mtb对利福平耐药的结果分析（以比例法药敏试验为金标准）

表3 Xpert Mtb／RIF方法及测序联合检测痰标本的Mtb及利福平耐药

三、16例传统药敏和Xpert Mtb／RIF检测结果不一致患者菌株rpoB基因测序

16例不一致患者中，涂阳患者13例，涂阴患者3例，测序结果与传统药敏结果一致的有5例，测序结果与Xpert RIF结果一致的有11例，以比例法药敏和测序结果为判断标准，Xpert Mtb／RIF方法检测涂阳患者利福平耐药的敏感度为93．9%（46／49）、特异度为97．0%（258／266）；检测涂阴患者利福平耐药的敏感度为100．0%（2／2）、特异度为94．3%（33／35）；全部患者检测的敏感度为94．1%（48／51）、特异度为98．6%（291／295）。对两种方法进行统计学分析，进行kappa一致性比较，K＝0．920，两种方法具有较好的一致性，结果见表3。

讨 论

结核病的早期诊断及其耐药性的检测，对于很好地控制耐药结核病的传播具有十分重要的意义。随着分子生物学的发展，近年来涌现出很多方法用于Mtb的鉴定及其耐药性检测。GeneXpert核酸扩增检测系统是将样品准备、定量PCR扩增和荧光检测集于一身的核酸扩增检测分析系统。只需要在独立的反应孔中加入待检测的生物样品，2h内便能快速检测出患者是否患有结核病，以及是否对利福平耐药。同时由于使用可以密封的一次性反应盒将样品准备所需的所有试剂都提前装入其中，减少了操作过程中污染及环境因素导致的实验结果不精确的可能性。目前，GeneXpert检测系统已开始应用于白血病，以及肠病毒和链球菌等多种病原微生物的检测。

一、Xpert Mtb／RIF检测原理及国外评估结果

本研究使用的Xpert Mtb／RIF核酸检测方法采用GeneXpert检测系统，是一种半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术，针对rpoB基因81bp利福平耐药核心区间（RRDR）设计引物、探针，检测其是否发生突变，进而用于诊断患者是否感染了Mtb，以及是否对利福平耐药（rpoB序列存在突变）［6］。Helb等［6］研究结果显示，Xpert Mtb／RIF在痰标本中的检测极限为131CFU（菌落形成单位）／ml，灵敏度远高于涂片检测。在越南选取的29例涂阳患者采用Xpert Mtb检测Mtb，敏感度达到100．0%；78例涂阴患者Xpert Mtb检测敏感度和特异度为71．7%和100．0%。在乌干达选取的84例涂阳患者，Xpert Mtb检测敏感度和特异度为98．4%和100．0%；以传统药敏作为金标准，9例耐药患者均被Xpert RIF检测为耐药，55例敏感患者有1例被检测为耐药，通过测序发现该例菌株rpoB基因511位点发生突变，证实为耐药。2010年，在南美洲、非洲和亚洲的多个国家级结核病实验室纳入1843例患者对Xpert Mtb／RIF检测结果进行了验证评估，研究结果表明：该方法检测Mtb的敏感度和特异度分别为96．0%和98．6%，检测利福平耐药的敏感度和特异度为97．6%和98．1%，不一致者经测序更正后，利福平耐药检测的敏感度和特异度达到99．1%和100．0%［7］。

二、Xpert Mtb／RIF检测Mtb效能分析

本研究在区县级结核病防治机构采用临床就诊的肺结核可疑症状患者的痰标本，通过Xpert Mtb／RIF检测Mtb及其利福平耐药性，结果显示，Xpert Mtb／RIF检测Mtb的敏感度达到95．0%，特异度为89．6%，特异度略低于国外相关报道，可能是由于作为金标准的传统固体培养试验本身的敏感度并不是很高所致（国外多以液体培养作为金标准）。35例培养和Xpert Mtb诊断结果不一致患者通过查找相关临床信息，17例培养阴性而Xpert Mtb检测为阳性患者中，6例为涂片阳性，并且17例患者临床诊断结果均为继发性肺结核，Xpert Mtb诊断与临床诊断结果一致。18例培养阳性而Xpert Mtb阴性患者中，6例为涂片阳性，考虑这18例患者可能为非结核分枝杆菌感染所致。

三、Xpert Mtb／RIF检测利福平耐药效能分析

以比例法药敏试验为金标准，Xpert Mtb／RIF检测Mtb对利福平耐药的敏感度和特异度分别为89．1%、96．3%。通过对16例不一致患者菌株进行rpoB耐药基因核心区间测序，将比例法药敏试验和差异菌株测序结果联合作为金标准，Xpert Mtb／RIF方法检测利福平耐药的敏感度为94．1%（48／51）、特异度为98．6%（291／295），此结果与国外报道结果基本一致［7］，Xpert Mtb／RIF检测可以很好地诊断初诊患者是否对利福平耐药。

总之，Xpert Mtb／RIF是一种可以快速、直接可靠、高特异地检测出结核病患者及是否对利福平耐药的新诊断技术。2010年12月，WHO推荐使用该方法对耐多药可疑者和可疑Mtb与HIV双重感染患者进行结核病诊断［8］。本研究通过对Xpert Mtb／RIF进行临床应用评估，证明该方法在我国基层实验室对于结核病诊断及利福平耐药患者的筛查方面具有一定的应用前景。

［1］World Health Organization．Global tuberculosis control：surveillance，planning，financing：WHO report 2008．Geneva：World Health Organization，2008．

［2］赵雁林，尚美．我国当前结核病实验室诊断的现状．中华检验医学杂志，2007，30（7）：97-98．

［3］Varma-Basil M，El-Hajj H，Colangeli R，et al．Rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from India and Mexico by a molecular beacon assay．J Clin Microbiol，2004，42（12）：5512-5516．

［4］赵雁林，姜广路．痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册．北京：中国协和医科大学出版社，2009．

［5］中国防痨协会基础专业委员会．结核病诊断实验室检验规程．北京：中国教育文化出版社，2006．

［6］Helb D，Jones M，Story E，et al．Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampin resistance by use of on-demand，near-patient technology．J Clin Microbiol，2010，48（1）：229-237．

［7］Boehme CC，Nabeta P，Hillemann D，et al．Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance．N Engl J Med，2010，363（9）：1005-1015．

［8］World Health Organization．Roadmap for rolling out Xpert Mtb／RIF for rapid diagonisis of TB and MDR-TB．Geneva：World Health Organization，2010．