探讨标本与固相抗体反应时间对ELISA法检测HBsAg结果的影响

曹青梅，乔飞飞（延安大学附属医院，陕西 延安 716000）

乙型肝炎病毒（HBV）是严重危害人类健康的病毒之一。HBV可诱发一系列肝脏疾病，严重影响患者的生活质量，给其家庭和社会带来沉重的负担[1]。乙型肝炎表面抗原（HBsAg）是临床实验室最为常用的检验项目之一，常作为乙型肝炎的感染指标之一。卫生部要求从2010年10月1日起执行《中华人民共和国药典（2010版）》后，HBsAg的测定由原来的ELISA一步法（一步法）改成了ELISA二步法（二步法），即将待测标本与固相抗体反应的时间由原来的0min改为60min，使实验室的操作步骤增多，同时延长了反应时间。部分实验室为了操作简便，仍沿用一步法，现就待测标本与固相抗体反应不同放置时间对试验结果的影响报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料:标本来自2012年1月～2012年4月，延安大学附属医院感染病科住院患者。所需标本均空腹抽血3 ml，离心分离血清，用时间分辨荧光法（TRFIA）定量检测乙型肝炎表面抗原。选取HBsAg浓度＞30ng/ml的血清标本100例，HBsAg浓度为0.5～30ng/ml（不包括0.5ng/ml）的血清标本50例，将这些标本分装后置于－20℃冰箱保存，以备统一检测。保存过程中不可以反复冻融。所选取标本均无溶血、黄疸。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 试剂:时间分辨荧光法（TRFIA）试剂由中山大学达安基因股份有限公司提供，酶联免疫吸附试验法试剂由厦门英科新创科技有限公司提供。

1.2.2 仪器:测定仪器为美国Perkin Elmer公司生产的1235时间分辨荧光检测仪；上海科华实验室生产的KHB ST360的酶标仪。

1.3 测定方法:取出试剂盒（包括反应板、酶标抗体、显色剂），平衡至室温，将所收集标本自然溶解平衡至室温，用ELISA法做第一步（待测标本与固相抗体的反应）放置60min、30min、0min的对比试验，具体步骤如下:①编号后96个孔均加20μl样品稀释液，并在一二孔分别加阳性对照，阴性对照，第三孔为空白对照，其余93个孔加待测血清100μl，置37℃温育0min、30min、60min；②在每孔加酶标记抗体50μl，置37℃温育30min，洗板5次并拍干；③每孔加底物A、B各50μl，混匀置37℃温育30min；④每孔加终止液50μl，混匀，用酶标仪测定各孔OD值，再经过阴性对照对比。临界值=阴性对照孔OD平均值×2.1（阴性对照OD均值小于0.05时以0.05计算），样本OD值S/C.O.≥1者为阳性，反之为阴性。

1.4 统计学处理:采用SPSS 13.0软件包进行统计学分析，计数资料用阳性率来描述，阳性率的比较采用χ2检验，两组间的多重比较用χ2分割检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组对比试验结果:见表1。

表1 三组对比试验结果（例）

2.2 三组对比试验阳性率的比较:三组对比试验的阳性率均较高，但总体率的差异有统计学意义（P＜0.05），详见表2。为了进一步的分析两两之间的差异，再采用χ2分割，详见表3，放置0min与30min差异有统计学意义（P＜0.05），放置0min与60min差异有统计学意义（P＜0.05），放置30min与60min差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 三组对比试验阳性率的比较（例）

表3 三组对比试验两两比较（例）

3 讨论

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的一种我国高发的传染病。乙型肝炎表面抗原（HBsAg）存在于HBV的外壳部分，是乙肝患者血清中首先出现的病毒标志物。可用于乙肝的早期诊断和普查，在急性肝炎潜伏期即可出现阳性[2]。HBsAg是临床上常见的检测项目，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HBsAg是目前临床实验室最普遍、最经济的方法，它具有快速、简便、灵敏度高、特异性好和成本低等优点，因此广泛应用于中小型医院[3]。

ELISA-夹心法是待测成分与包被于固相上的包被物发生反应后，再与酶标记成分反应，形成目的复合物:包被物—待测物—标记物[4]。待测标本的血清加入反应板后，待测物就开始与包被物（固相抗体）发生反应，故待测标本与固相抗体的反应时间越长，反应就越充分，加酶标抗体后形成的夹心复合物也就越多。一步法是将待测标本与酶标记抗体同时加入包被板，而二步法则将待测标本加入包被板温育60min后再加酶标记抗体。由于二步法的操作步骤较多，反应时间也较长，部分实验室在ELISA法由原来的一步法改成了两步法后仍沿用一步法，致使对检测结果尤其是弱反应性结果造成了一定的影响。已有资料表明，在我国的乙型肝炎病毒（HBV）感染人群中，有一部分血清HBV表面抗原（HBsAg）呈低水平状态存在，且部分感染者存在病毒复制，因此忽略弱反应性结果，尤其是阳性判断值以下的结果将造成人群的漏检[5-6]。

本试验结果显示，HBsAg浓度大于30ng/ml的血清标本，用一步法、二步法及将待测标本与固相抗体反应时间设为30min，他们的结果相符，差异无统计学意义（P＞0.05）。而对于HBsAg浓度为0.5～30ng/ml的血清标本，当待测标本与固相抗体的反应时间为0min时，其结果与将反应时间设为30min和60min差异均有统计学意义（P＜0.05），并且与定量结果也不相符。因此，只有保证待测标本与固相抗体反应的时间至少为30min，其结果才可以与定量检测的结果相符。

近几年来，临床上乙型肝炎表面抗原呈现弱反应性的标本越来越多，目前对这种弱阳性反应没有一个统一的判断标准，因此对检验工作造成了困扰，并可能引起医疗纠纷。HBsAg弱反应性的形成原因主要在于[2]:①HBsAg滴度低，常规方法不能检出；②HBsAg隐匿在HBsAg/抗-HBs复合物中；③病毒整合后基因替代突变缺失或重排；④HBV变异株产生HBsAg缺陷，抗原免疫源性改变；⑤干扰因素:内源性干扰因素如类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、溶菌酶等，外源性干扰因素如溶血、细菌污染、凝固不全等。这些标本的检测结果可能为阴性或处在灰区，但具有传染性，对乙型肝炎的预防及控制埋下了隐患，同时也可能导致输血相关乙型肝炎的传播[7]。因此，对低水平存在的血清HBsAg进行有效检测，具有重要的临床及流行病学意义。

实验室人员通过缩短待测标本与固相抗体的反应时间而简化实验室操作，虽然缩短了等待时间，但对于低浓度的标本，待测标本与固相抗体反应时间过短，极易引起漏检，从而对临床医生为患者的疾病诊治带来了不便。为此，在检测的过程中，待测标本与固相抗体的反应时间最少为30min以上。

[1]熊承良.人类精子学[M].武汉:湖北科学技术出版社,2002:99.

[2]刘荣静,习 浩,林列坤.乙型肝炎病毒表面抗原弱反应性标本的检测及临床意义[J].检验医学与临床,2010,27(5):404.

[3]易 珍,汤春园,徐明辉,等.乙型肝炎表面抗原弱阳性结果探讨[J].应用预防医学,2008,14(3):182.

[4]郑怀竞,韩 松.临床检验ELISA指南[M].北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1994:14.

[5]陈 瑜,钟步云,徐根云,等.低水平血清乙肝病毒表面抗原测定及其临床意义[J].中华检验医学杂志,2001,24(1):39.

[6]彭 静,管 青,王 斌,等.HBsAg检测结果弱反应性的分析与处置[J].临床检验杂志,2008,26(4):284.

[7]徐树良,石 斌,谈 唯,等.荧光定量PCR对ELISA-HBsAg“灰区”标本的再分析[J].中国输血杂志,2003,16(1):24.