缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子在骨肉瘤组织中的表达及其与血管生成的关系

廉红星 李玉强 赵 敏 刘瑞吉

(河北省秦皇岛市第一医院骨三科，河北 秦皇岛 066000)

骨肉瘤也称成骨肉瘤，是最常见的原发恶性骨肿瘤，常发生于青少年，恶性程度高，约30%的患者对化疗药物不敏感，预后差[1]。2000-01—2005-12，我们应用免疫组织化学(SP)法，观察了缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)35例在骨肉瘤组织中的表达情况，用CD34标记血管内皮细胞，计算微血管密度(MVD)，探讨HIF-1α和VEGF在骨肉瘤血管形成中所起的作用，并选取14例骨软骨瘤患者对照观察，结果如下。

1 资料与方法

1.1 诊断标准 骨肉瘤、骨软骨瘤诊断标准均参照《软组织与骨肿瘤病理学和遗传学》[2]。

1.2 一般资料 35例骨肉瘤和14例骨软骨瘤均为我院病理科存档标本蜡块。骨肉瘤中男22例，女13例；年龄11～55岁，平均(21.1±0.5)岁；骨肉瘤临床分期[2]：Ⅱa 5例，Ⅱb 18例，Ⅲ期12 例。骨软骨瘤中男10例，女4例；年龄10～34岁，平均(19.5±0.4)岁。

1.3 实验方法 4 μm厚度石蜡切片，60 ℃烤片3 h，SP法染色，苏木素复染细胞核，盐酸酒精分化，水洗返蓝，酒精梯度脱水，二甲苯透明，封固切片。用磷酸盐缓冲液(PBS)取代一抗作阴性对照，用已知的阳性切片作为阳性对照。

1.4 结果判定 ①HIF-1α、VEGF SP染色阳性反应为棕黄色和(或)棕褐色颗粒，HIF-1α主要定位于细胞核，VEGF主要定位于细胞质和细胞膜。每张切片选取10个高倍视野(×400)观察阳性细胞占细胞总数的百分比，无阳性细胞者为阴性(-)，<50%细胞着黄色或<30%细胞着棕黄色者为阳性(+)，>50%细胞着黄色或>30%细胞着棕黄色者为强阳性(++)。染色阳性及强阳性合并为染色阳性组，与染色阴性组比较。②CD34特异性标记肿瘤组织的新生血管，MVD根据CD34表达量参照Bevilacqua P等[3]报道的方法计算。染色阳性表达于血管内皮细胞，阳性着色为与背景明显有别的单个内皮细胞或细胞簇团，呈棕黄色，只要与邻近血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开，均看作1个微血管，染色模糊、肌层较厚或管腔大于8个红细胞直径的血管不计数。先在低倍镜(×100)下选取骨肉瘤组织阳性染色血管高密度区，选择3个着色最密集的区域(新生血管热点区)，然后在高倍镜(×400)下计数视野范围内阳性染色的微血管。每例标本取3个视野，取其平均值作为每例标本的MVD。

2 结 果

2.1 HIF-1α、VEGF在骨肉瘤组织中的表达 见表1。

由表1可见，HIF-1α蛋白染色主要表达于细胞核，在骨肉瘤中阳性表达率高于在骨软骨瘤中阳性表达率(P<0.05)。VEGF蛋白染色主要表达于细胞质及细胞膜，在骨肉瘤中阳性表达率高于在骨软骨瘤中阳性表达率(P<0.05)。

表1 HIF-1α、VEGF在骨肉瘤组织中的表达例(%)

与骨软骨瘤比较，*P<0.05

2.2 HIF-1α、VEGF表达与骨肉瘤Enneking分期的关系 见表2。

表2 HIF-1α、VEGF表达与骨肉瘤Enneking分期的关系 例(%)

与Ⅲ期比较，*P<0.05

由表2可见，Ⅲ期骨肉瘤的HIF-1α、VEGF蛋白的表达强度与Ⅱa期、Ⅱb期比较差异有统计学意义(P<0.05)，而Ⅱa期与Ⅱb期的表达强度比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 HIF-1α、VEGF在骨肉瘤中表达的相关性 见表3。

表3 HIF-1α、VEGF在骨肉瘤中表达的相关性 例(%)

由表3可见，35例骨肉瘤标本中有14例(40.0%) HIF-1α和VEGF的表达同时呈阳性，13例(37.1%)HIF-1α和VEGF的表达同时呈阴性，8例(22.9%) HIF-1α和VEGF的表达呈不一致性。HIF-1α和VEGF在骨肉瘤中的表达呈正相关。

2.4 HIF-1α、VEGF表达与MVD的关系 见表4。

表4 HIF-1α、VEGF表达与MVD的关系

表4 HIF-1α、VEGF表达与MVD的关系

nMVD HIF-1α(+)1528.12±7.84*(-)2012.12±3.86VEGF(+)2132.36±7.52△(-)1414.10±3.43

与HIF-1α(-)比较，*P<0.01；与VEGF(-)比较，△P<0.01

由表4可见，HIF-1α(+)、VEGF(+)的MVD值均显著高于HIF-1α(-)、VEGF(-)(P<0.01)。

3 讨 论

实体瘤生长迅速，局部血管无法提供充足血运，以及微循环破坏、贫血等原因导致实体瘤组织中氧浓度普遍低于2%[4]。骨肉瘤组织细胞中存在的低氧环境不仅抑制肿瘤细胞生长，而且调控肿瘤细胞产生适应性反应而存活[5]。缺氧诱导因子1(HIF-1)是作为被低氧诱导的、连接在促红细胞生成素基因低氧反应元件上的一个核因子被发现[6]。缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体细胞中，主要由HIF-1α和HIF-1β 2个亚单位组成，其中HIF-1α主要依赖于细胞间的氧供，决定了HIF-1α的活性。缺氧是实质性肿瘤微环境的基本特征之一，缺氧状态可诱导一系列特异性的与血管新生、缺氧代谢密切相关的基因表达，帮助肿瘤细胞适应缺氧环境，在此过程中起关键作用的是HIF-1α[7]。本研究结果显示，骨肉瘤组织中HIF-1α蛋白阳性表达率为34.3%(12/35)，与骨软骨瘤比较差异有统计学意义(P<0.05)，HIF-1α在骨肉瘤中存在过表达现象，同时对MVD的测定显示HIF-1α与骨肉瘤中血管生成明显相关，与骨肉瘤的分期也密切相关，以上均提示HIF-1α在骨肉瘤的发生、发展以及血管生成中可能起到重要作用。

VEGF是刺激肿瘤血管生成最关键的因子，是血管内皮细胞特异性有丝分裂原，能特异结合血管内皮细胞中表达的受体，促进血管内皮细胞分裂增殖和新生血管的形成，并增加血管通透性，增加毛细血管后静脉和小静脉的通透性，引起细胞外基质改变从而促进新基质形成，为肿瘤生长、浸润及转移提供基础[8]。VEGF是HIF-1调控的最重要靶基因之一，参与肿瘤血管生成，为目前评价骨肉瘤血管生成最客观的指标之一。本研究结果显示，VEGF在骨肉瘤中也存在过表达现象，阳性表达率为82.9%(29/35)，显著高于在骨软骨瘤中阳性表达率(P<0.05)。

本研究结果还显示，HIF-1α和VEGF在骨肉瘤的发生、发展中所起作用具有某种程度的关联性，HIF-1α和VEGF均为阳性的骨肉瘤中MVD明显高于两者均为阴性时，提示两者可能在促进肿瘤血管生成中也存在协同效应，但其具体机制还需进一步研究，以期为抗肿瘤治疗提供新的对策。

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[5] 邵进.低氧诱导因子1在骨肉瘤组织细胞中的表达及其调控机制[J].医学综述，2010，16(12)：1761-1763.

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[8] 茅文斌，邵增务.iNOS与HIF-1α仪在骨肉瘤中的表达及其与血管生成的关系[J].中国骨肿瘤骨病，2006，5(4)：210-213.