理性设计和构建过量合成莽草酸的大肠杆菌代谢工程菌

李明明，陈献忠，周丽，沈微，樊游，王正祥

1 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122

2 江南大学生物工程学院, 江苏 无锡 214122

莽草酸是芳香族氨基酸和一些手性化合物合成的重要中间体[1]，本身具有众多的生理功能和药理作用，如通过影响花生四烯酸代谢来抑制血小板聚集，从而可以抑制动、静脉血栓及脑血栓形成；具有较强的抗炎、镇痛作用，是抗病毒和抗癌药物的中间体[2]。此外，莽草酸是合成有效抗禽流感药物-达菲的重要原料[3]。莽草酸途径广泛存在于细菌、子囊真菌、寄生虫和植物中[4-7]。

传统的莽草酸生产方式主要有两种：从八角属植物的果实中提取[8]，或通过化学合成手段获得。前者由于原材料的生长受地域限制及气候的影响，严重制约了莽草酸的大规模生产[9]；后者由于生产工艺复杂、产量低、成本高也不能满足莽草酸的大量需求。微生物发酵法生产莽草酸在生产规模、生产工艺等方面具有显著的优势。因此，通过代谢工程育种获得高产莽草酸的微生物菌种并发酵生产莽草酸具有广阔的应用前景。大肠杆菌由于遗传背景清楚、生长速度快、发酵周期短以及易于分子操作等优势，是代谢工程育种中最常用的宿主。如图1所示，大肠杆菌中莽草酸途径是芳香族氨基酸合成的共同途径，包含7步酶催化反应，最终生成分支酸。首先由糖酵解途径中间产物磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)和 HMP途径的4-磷酸赤藓糖 (E4P)缩合形成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸 (DAHP)起始，该反应由aroF、aroG和aroH基因编码的DAHP合成酶催化，这3个同工酶分别受到L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸的反馈抑制[10]。PEP来自糖酵解途径，也可由 ppsA基因编码的磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A催化丙酮酸转化得到。tktA基因编码的转酮酶A是磷酸戊糖途径中生成E4P的关键酶。DAHP经过一系列反应后生成代谢中间产物莽草酸，后者在莽草酸激酶的作用下生成莽草酸-3-磷酸 (S3P)，并最终合成 3种芳香族氨基酸。PEP和E4P是莽草酸合成的前体物质，它们的合成和积累直接决定着莽草酸的合成能力。大量文献表明，通过消除竞争途径，解除限速步骤或增强前体代谢产物的供应，从而加强目的代谢产物的积累是微生物代谢工程常用的一种行之有效的方法[11]。

图1 大肠杆菌莽草酸途径Fig. 1 Pathway of shikimic acid in E. coli.

基于 Red重组系统的基因删除技术是最近几年来国际上进行细菌代谢工程研究的常用方法之一。Red重组系统的原理是在来源于λ噬菌体的exo、bet、gam三个基因控制的重组酶的作用下，染色体DNA可以与外源线性DNA片段通过两翼较短的同源序列高频重组，使其整合到染色体上，并将染色体上的对应序列置换下来[12]。本实验在Red重组系统的基础上，利用大肠杆菌自身所含有的Xer重组酶能够识别dif序列的特点[13]，运用dif-dif重组将目的基因的两端同源臂连接，从而去除了其中的抗性基因标记。本研究中的基因删除原理如图2所示。

图2 基因删除流程Fig. 2 Schemes of gene inactivation approach.

为了有效利用大肠杆菌莽草酸途径合成莽草酸，在分析大肠杆菌莽草酸代谢网络的基础上，首先利用Red-Xer重组系统删除了莽草酸途径中莽草酸激酶的编码基因aroL和aroK，从而阻断了莽草酸向莽草酸-3-磷酸的代谢反应，提高了莽草酸的累积。通过删除编码 EIICBglc蛋白的ptsG基因部分阻断了大肠杆菌依赖于PEP的葡萄糖过磷酸转移酶系统(PTS)，使得细胞的葡萄糖运输主要依赖于半乳糖协同运输系统进行[14]。为了减少副产物奎宁酸 (QA)的生成，进一步删除了 ydiB基因。最终获得的大肠杆菌代谢工程菌的莽草酸合成和累积能力显著提高。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和引物

大肠杆菌Escherichia coli CICIM B0013由本中心筛选、保藏；E. coli JM109由本中心保藏；质粒pKD46 (温敏型复制子，含有阿拉伯糖启动子调控的gam、bet和exo基因，Ampr)由本中心保藏；质粒 pSK-EcdifGm (含有 dif位点，Ampr，Gmr)由本实验室构建并保藏；pMD18-T-simple购自TaKaRa (大连公司)。本实验所用到的大肠杆菌菌株见表1，本实验所用引物序列见表2。

1.1.2 培养基和主要试剂

大肠杆菌培养用培养基和质粒增殖培养基LB (/L)：5 g酵母粉，10 g蛋白胨，10 g NaCl；固体培养基在此基础上添加 1.5%～2%的琼脂粉。培养基中氨苄青霉素钠和庆大霉素的终浓度分别为 100 μg/mL 和 30 μg/mL。

发酵培养基 (/L)：13 g Na2HPO4·H2O，3 g KH2PO4，0.5 g NaCl，0.1 g NH4Cl，1.2 g MgSO4，0.7 g L-苯丙氨酸，0.35 g L-色氨酸，0.7 g L-酪氨酸，0.3 g柠檬酸铁铵，2.1 g一水合柠檬酸，0.01 g对羟基苯甲酸，0.01 g对氨基苯甲酸钾，0.01 g 2,3-二羟基苯甲酸，15 g酵母抽提物，20 g蛋白胨，25 g葡萄糖。

dNTPs、Taq DNA聚合酶购自上海华诺公司；PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒以及DNA片段快速胶回收试剂盒均购自北京博大泰克生物基因技术有限公司；限制性核酸内切酶及T4 DNA连接酶购自TaKaRa (大连)公司；L-阿拉伯糖购自Sigma公司；引物合成及测序由上海生工生物技术有限公司完成；其余试剂均是国产分析纯。

表1 本实验所构建的重组菌Table 1 Escherichia coli strains used in this study

表2 本实验所用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2 利用Red-Xer重组系统删除基因

根据文献报道方法[13,15]，分别进行 aroL、aroK、ptsG和ydiB基因的删除。

1.2.1 利用Red-Xer重组系统删除aroL基因

用以 aroL基因上下游设计的引物 aLup和aLdn扩增大肠杆菌染色体DNA上的aroL基因，片段大小为575 bp，PCR产物克隆入pMD18-T-simple载体中，获得重组质粒 pMD-aroL。以该重组质粒为模板，用引物Lverp、Lverdn进行反向PCR扩增，PCR产物与difGm片段连接得到重组质粒 pMD-aroL′::difGm。以重组质粒pMD-aroL′::difGm 为模板，用第一组引物进行PCR扩增得到片段aroL′::difGm，即aroL基因的突变盒。

将aroL基因突变盒电击转入出发菌B0013/pKD46细胞后立即加入含有浓度为1 mmol/L的L-阿拉伯糖的液体LB培养基，30 ℃、100 r/min条件下后培养4～6 h，然后涂布于含有庆大霉素的抗性平板，利用引物YL、aLdn进行菌落PCR鉴定获得正确重组的转化子并转接于含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，在30 ℃培养条件下多次转接传代后，划线分离出单菌落并挑选出庆大霉素抗性丢失的转化子，并用YL、aLdn引物进行菌落PCR验证。

1.2.2 利用 Red-Xer重组系统删除 aroK、ptsG和ydiB基因

与删除aroL基因的方法相同，首先构建aroK基因的突变盒。以aKup、aKdn为引物，利用Taq DNA聚合酶扩增大肠杆菌的aroK基因，PCR产物克隆入 pMD18-T-simple载体中，获得重组质粒 pMD-aroK。以上述重组质粒为模板用引物Kverp和Kverdn，进行反向PCR扩增，并克隆入difGm片段得到重组质粒pMD-aroK′::difGm。以重组质粒 pMD-aroK′::difGm 为模板，用引物aKup和 aKdn进行 PCR扩增得到片段aroK′::difGm。将片段 aroK′::difGm 电转入 SA1菌中进行Red-Xer重组，实现aroK基因的突变。ptsG和ydiB基因删除的技术路线同上。

1.3 摇瓶培养

将保藏在−70 ℃甘油管中的菌体划线在固体平板上，置于37 ℃恒温箱培养24 h后接单菌落于液体LB培养基中，37 ℃、200 r/min培养9 h作为种子培养液。用种子培养液收集适量菌体，以发酵培养基重悬后在37 ℃、200 r/min摇瓶培养，每隔2 h取样测OD600，确定菌株生长情况。用生物传感仪测量发酵液中葡萄糖残留量，从而确定菌体消耗葡萄糖的情况。为了防止在培养过程中菌体产酸使培养基pH降低从而影响菌体的生长，可在培养过程添加适量的碳酸钙进行中和。本研究中所有发酵实验均重复至少3次，检测数据取平均值进行分析。

1.4 发酵及代谢物分析

细胞密度用紫外可见分光光度计在 600 nm波长处测定，细胞干重 (DCW) 是由 DCW 与OD600测定的标准曲线换算得到，本实验所用菌株CICIM B0013的细胞干重 (DCW)与OD关系为：1 OD600=0.38 g/L DCW[16]。培养基中的葡萄糖用生物传感仪 (SBA40C)(山东省科学院生物研究所)检测。

莽草酸、奎宁酸、丙酮酸、以及乙酸和乳酸等有机酸用高效液相色谱分析。取1.5 mL的发酵上清液加入等体积的 10%的三氯乙酸混合均匀，4 ℃放置2 h沉淀杂质蛋白 (测定胞内有机酸时先用超声波破碎细胞后按前述方法处理)，室温12 000 r/min离心8 min，上清液经0.45 μm的膜过滤后，用高效液相的方法测定发酵液中的代谢产物含量。

高效液相色谱分析条件：色谱柱为 Aminex HPX-87H column (300 mm×7.8 mm；9 μm)，流动相为0.005 mol/L硫酸，流速为0.6 mL/min，紫外检测波长为210 nm，柱温为50 ℃，进样量为20 μL，测量停留时间为20 min。

2 结果与分析

2.1 基因删除

2.1.1 aroL基因的删除与鉴定

首先用 1.2.1的方法构建关键重组质粒pMD-aroL′::difGm，该质粒大小为4 057 bp，物理图片如图3A所示。将该重组质粒用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ进行酶切验证，获得2.7 kb和1.3 kb左右的两条电泳条带，见图3B。

图3 重组质粒 pMD-aroL’::difGm 的物理图谱 (A)及酶切验证 (B)Fig. 3 Map of recombinant vector pMD-aroL′::difGm(A) and identification by restriction enzyme (B). 1:pMD-aroL’::difGm/EcoR I; M: DNA marker.

以重组质粒pMD-aroL′::difGm为模板，PCR扩增获得aroL基因的突变盒aroL′::difGm，经纯化后电转化导入宿主菌 B0013/pKD46后涂布于庆大霉素抗性筛选平板上，挑取单菌落转接于无抗性的LB培养基平板上传代培养，最后用引物YL、aLdn进行菌落 PCR验证，原始菌株获得aroL基因 (片段大小为 575 bp)，转化子 SA1(aroL′::difGm)获得片段 aroL′::difGm (大小为1.3 kb左右)，其庆大霉素抗性基因 (Gm)丢失后，转化子SA1 (aroL′::dif)获得大小为365 bp的aroL′::dif片段 (图4)。表明aroL基因已经被成功敲除。

2.1.2 aroK、ptsG和ydiB基因的删除与鉴定

利用相似的策略删除 aroK基因。首先构建aroK删除片段aroK′::difGm并将其电转入宿主菌SA1/pKD46中。挑取转化子后，用引物YK、aKdn进行菌落 PCR扩增验证，出发菌株 SA1获得657 bp大小电泳图谱；转化子SA1 (aroK::difGm)获得1.4 kb左右的电泳图谱；其抗生素抗性基因丢失后，转化子SA2获得356 bp大小电泳图谱(图4)。即菌株SA1的aroK部分基因已被dif序列替换。

利用相似的策略进行删除 ptsG基因。首先构建删除片段ptsG′::difGm并将其电转入宿主菌SA1/pKD46中。以引物YG和pGdn进行菌落PCR验证，ptsG基因的大小为1.4 kb，整合到染色体DNA上的ptsG′::difGm片段大小为1.7 kb，经dif重组而丢掉Gm基因的转化子SA3的PCR结果为0.5 kb (ptsG′::dif的大小)，鉴定电泳图谱见图4，表明ptsG基因已经被成功敲除。

图4 大肠杆菌基因删除的PCR鉴定Fig. 4 Identification of genes knockout in E. coli. by PCR M: DL2000 DNA marker; 1: PCR product of aroL gene; 2:PCR product of aroL′::difGm; 3: PCR product of aroL′::dif; 4: PCR product of aroK gene; 5: PCR product of aroK′::difGm; 6: PCR product of aroK′::dif; 7: PCR product of ptsG gene; 8: PCR product of ptsG′::difGm; 9: PCR product of ptsG′::dif; 10: PCR product of ydiB gene; 11: PCR product of ydiB′::difGm; 12: PCR product of ydiB′::dif.

构建用于删除 ydiB基因的基因突变盒ydiB′::difGm并导入SA3细胞后，利用引物YB、yBdn进行菌落 PCR验证。ydiB基因的大小为0.6 kb，ydiB基因片段的大小 1.3 kb左右，经dif-dif重组而丢掉Gm基因的转化子PCR产物大小为0.3 kb左右 (ydiB′::dif的大小)。鉴定电泳图谱见图4，表明ydiB基因已经被成功敲除。

2.2 发酵实验结果

2.2.1 代谢工程菌的细胞生长和底物利用性能评价

分别考察出发菌 B0013和系列突变株(SA1、SA2、SA3和SA4)的细胞生长、葡萄糖消耗和莽草酸合成情况。

由图5可以看出，在发酵初期的4 h内，突变株与对照菌株的生长速度没有显著区别，但整个发酵周期来看代谢工程菌的对数生长期显著延长，并且SA3和SA4菌株更为突出，对数生长期达到了10 h。同时，表3表明，尽管出发菌株的比生长速率高于代谢工程菌株，但出发菌株的最终的细胞生物量仅为2.84 g/L，明显低于其余4株基因缺失突变株，其中SA4菌株的最大生物量较高，达到了5.71 g/L。有趣的是，随着基因的叠加删除，突变株的SA1、SA2、SA3和SA4最大细胞生物量也呈现出依次升高的趋势，分别达到3.45 g/L、3.94 g/L、5.24 g/L和5.71 g/L (图5，表 3)。由此可见，基因删除不仅影响大肠杆菌的细胞生长性能，对最终细胞生物量也产生了明显的影响。

图5 大肠杆菌B0013及其基因缺失突变株的细胞生长过程Fig. 5 Growth curve of B0013 and its SA-producing derivatives.

进一步考察了突变株及对照菌株的底物利用情况，结果如图6和表3所示。与突变株相比，出发菌株的葡萄糖利用速度最快，结合菌体生长情况可以看出，出发菌株的细胞快速生长可能是葡萄糖快速利用所引起的。与出发菌株相比，4株突变株在达到生长稳定期以后葡萄糖消耗速度下降更为显著，至发酵结束时，SA1菌株才基本利用完葡萄糖，而其余3株突变株的发酵液中均有不同程度的葡萄糖残余，其中SA3菌株的发酵液中的残余葡萄糖达到5 g/L左右。结合代谢工程菌的生长性能可以看出，删除莽草酸途径中的aroK和aroL基因在一定程度上降低了细胞对葡萄糖的利用速率，而 ptsG基因的删除对抑制细胞的葡萄糖利用效率更为显著。另一方面，发酵过程中细胞的快速生长和葡萄糖的快速利用对细胞的代谢活力要求较高，并且需要较高的溶氧水平。同时，分析了不同菌株发酵液的丙酮酸和乙酸 (数据未显示)，结果发现出发菌株中的乙酸和丙酮酸等有机酸的含量明显高于代谢工程菌，发酵液的pH相对较低，而SA2菌株的发酵液中丙酮酸水平显著高于 SA3菌株，SA4发酵液中含有一定浓度的乙酸。可以推测，出发菌株的高生长速率和低细胞生物量可能是由于培养过程中溶氧的限制导致有机酸的积累，从而限制了细胞后期的生长，而 ptsG基因的删除部分阻断了PEP依赖型的PTS系统，使得细胞的葡萄糖利用效率降低，一方面导致了菌体的生长缓慢，另一方面减少了PEP到丙酮酸的转化。

图6 大肠杆菌B0013及其基因缺失突变株的葡萄糖利用过程Fig. 6 Glucose consumption in B0013 and its SA-producing derivatives.

2.2.2 基因删除对莽草酸及中间产物合成的影响

分别考察了突变株及其出发菌株的莽草酸合成能力，培养48 h后发酵液中的莽草酸含量最高，结果如图7和表3所示。对照菌株B0013的莽草酸合成和累积水平最低，发酵液中几乎检测不到，说明大肠杆菌的莽草酸代谢受到细胞的严格调控。通过删除 aroL基因部分阻断了莽草酸代谢的下游途径后，菌株SA1莽草酸产量较出发菌有所提高，完全阻断莽草酸激酶反应 (删除aroL和aroK基因)，SA2发酵液中莽草酸含量达到67 mg/L。PEP作为莽草酸合成的前体，对细胞的莽草酸合成水平起着重要的调节作用，较高的 PEP前体可以有效提高目的产物的合成和积累。为考察PEP的累积对莽草酸的影响，在删除aroL、aroK基因基础上进一步删除了ptsG基因构建了PTS部分缺失的突变株，该突变株主要利用葡萄糖协助蛋白和葡萄糖激酶组成的非 PEP供能的葡萄糖转运系统，可以节约大量的 PEP用于莽草酸的合成。发酵结果显示，突变株SA3的莽草酸合成能力显著提高，发酵液中累积水平达到417 mg/L，相比于阻断莽草酸激酶反应，提高PEP前体对莽草酸合成和积累效果更为显著。在突变株 SA3的基础进一步删除了莽草酸/奎宁酸脱氢酶基因 (ydiB)，莽草酸最终产量达到576 mg/L，较出发菌株莽草酸产量为6 mg/L提高了90多倍。

同时，研究发现 ydiB基因的删除能够有效减少奎宁酸 (QA)合成和积累，发酵结束时SA3菌株的发酵液中QA的含量为128 mg/L，而敲除了 ydiB基因的 SA4突变株的 QA浓度仅为37 mg/L (表3)。由表3可知，尽管叠加删除基因后的突变菌株较出发菌株的细胞生物量逐步提高，至最终重组菌SA4在发酵液中菌体浓度达到5.71 g/L，莽草酸的产量也显著提高，但考虑到葡萄糖利用和发酵时间，莽草酸的产率和生产强度相对较低。

图7 不同菌株莽草酸产量比较Fig. 7 Comparision of shikimic acid production comparison in different strains.

表3 摇瓶发酵参数比较Table 3 Comparison of parameters in shake-flask experiments

3 讨论

本文通过连续删除大肠杆菌的aroL、aroK、ptsG和ydiB等4个基因获得了能够合成积累一定浓度莽草酸的代谢工程菌株。通过删除 aroL和 aroK基因能够提高细胞的莽草酸积累水平，但是由于芳香族氨基酸是细胞生长必需的，因此必须向培养基中添加适量的3种芳香族氨基酸后才能保证突变株的正常生长。ptsG基因删除使得细胞的PTS系统部分缺失，导致了细胞的葡萄糖转运系统由PEP供能形式改变为ATP供能形式，从而菌体前期由于没有足够的能量供给而生长较慢，对数生长期延长，同时使得最终菌体浓度得到提高。另一方面，敲除 ptsG基因后，PTS系统并未完全失活，还存在着甘露糖依赖的EIIABCDMan系统，该葡萄糖运输途径依然需要PEP的参与，同时大肠杆菌还存在非PTS系统的葡萄糖运输途径 (如半乳糖:H+-葡萄糖激酶系统等)，但这些葡萄糖运输途径的活性相对较低，也是导致葡萄糖代谢速率变慢，从而影响了底物利用效率和细胞生物量的原因之一[17]。更重要的是ptsG基因的缺失避免了PEP的过度消耗，为莽草酸合成和积累提供了更多的前体，因此能够显著提高细胞的莽草酸合成和积累能力。奎宁酸是莽草酸合成途径中的主要副产物，该副产物的形成不仅降低了莽草酸的产量和得率，更重要的是给下游的莽草酸分离提取工艺带来了较大的不便。删除 ydiB基因不仅降低了副产物奎宁酸的生成，同时显著提高了莽草酸的积累。

利用微生物发酵的方法生产莽草酸成为近几年来国际上解决莽草酸需求的热点。事实上，微生物合成莽草酸的主要受限步骤是PEP和E4P的利用率[18]。自1885年，Eykman首次从莽草中分离出莽草酸以来，国际上对它的研究就一直没有停止过[19]。Frost课题组针对大肠杆菌过量合成莽草酸的代谢工程开展了系统研究，在删除相关基因的基础上过量表达glf、glk、aroFFBR、tktA和 aroE基因，获得的代谢工程菌的莽草酸合成水平在10 L发酵罐中达到87 g/L，莽草酸得率为0.36 mol/mol[20]，这是迄今报道最高的莽草酸生产水平。杨婕等[21]在E. coli JM83的基础上敲除aroL基因并游离表达了aroG、ppsA和tktA等3个基因，摇瓶水平下莽草酸产量达到 94 mg/L，国内还未见有利用代谢工程菌大规模发酵生产莽草酸的相关报道。本文构建的代谢工程菌的莽草酸产量为568 mg/L，相比国外研究水平依然有很大差距。为了进一步提高莽草酸产量，还可以进行以下尝试：一是通过过量表达关键酶基因提高细胞的莽草酸代谢能力；二是提高莽草酸上游代谢途径的底物利用率；三是降低产莽草酸过程的副产物的形成。

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