医用超声耦合剂体外细胞毒性检测的探讨

高静贤，王莎莎，金梦，严小莉

江苏省医疗器械检验所，南京市，210022

医用超声耦合剂是超声诊断与治疗操作中的专用制剂。为了确保其符合安全、有效的原则，国家食品药品监督管理局早在1998年就制定了耦合剂的行业标准。随着耦合剂产品的发展，相关部门已对相应的标准进行了修订，新版的YY0299-2008《医用超声耦合剂》标准已于2010年6月1日起实施，标准对产品的生物相容性提出了要求，依据与皮肤短时间接触的特点，从GB/T16886《医疗器械生物学评价》标准中选择试验方法。标准中要求按照GB/T16886.5-2003中规定的直接接触法进行试验，在短时间（24 h以内）接触条件下，产品应无细胞毒性[1]。细胞毒性试验作为评价材料毒性的重要指标，以其简便、快捷、灵敏性高、重现性好、节省动物，并且试验结果有一定的临床相关性等优点被列为首选试验项目[2]。GB/T16886.5-2003中规定了3类试验方法，即浸提液试验、直接接触试验以及间接接触试验（包括琼脂覆盖法和滤膜扩散法）[3-4]。ISO10993-5:2009标准的附录C规定了MTT法检测细胞毒性的试验步骤。本试验选取了无菌型超声耦合剂，在不同的试验条件下采用MTT法以及间接接触法中的琼脂覆盖法对其进行细胞毒性评价，以探讨医用超声耦合剂细胞毒性的检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验细胞选取L929小鼠成纤维细胞株，购自中国科学院上海细胞所。主要药品与试剂：RPMI1640培养液（GIBCO，USA），胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），MTT（AMRESCO，USA），DMSO（AMRESCO，USA）。

1.2 试验方法

1.2.1 MTT（四唑盐）比色法

取无菌型与消毒型医用超声耦合剂，按照1 mg/mL、5 mg/mL、25 mg/mL、100 mg/mL及200 mg/mL的比例分别加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，并置于37oC放置24 h制备浸提液。取高密度聚乙烯浸提液作为阴性对照品；5%的DMSO溶液作为阳性对照。将培养至近汇合的L-929细胞消化，稀释为1×104U/mL与1×105U/mL，分别接种于96孔培养板中，每孔加入100 μL。在37oC、5%CO2培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后将每孔中原培养液吸除。空白对照组加新鲜培养液200 μL，各组加样品200 μL：阴性与阳性对照样品浸提液，置CO2培养箱中继续培养。于更换培养液后的24 h将细胞接种密度为105个的培养板取出，置倒置显微镜下观察细胞形态。并每孔加入20 μL质量浓度为5 g/L的MTT溶液，继续培养4 h后弃去孔内液体，加入200 μL DMSO，置振荡器上振荡10 min后，选择570 nm 在ELX800UV型酶标仪上测定光密度（optical density,OD）值，按以下公式计算相对增殖率(relative growth rate，RGR)：RGR=试验组吸光度值／对照组吸光度值×100%，并判定细胞毒性级别。

于更换培养液后的72 h将细胞接种密度为104个的培养板取出重复以上MTT试验。

1.2.2 琼脂覆盖法

将培养至近汇合的细胞稀释成2.5×105U/mL接种于6孔培养板中，设阴性对照组、阳性对照组及样品组，每组设3个平行样，各孔加入2 mL，放于CO2培养箱中培养至近汇合状态。将溶化的琼脂培养基与2倍浓缩的含10%血清的RPMI 1640培养基等比混合制成混合琼脂培养基，使琼脂的最终浓度为2%。弃去上清后每孔加入2 mL混合琼脂培养基，待琼脂层凝固后，分别加入2 mL新鲜配制的0.01%中性红活体染色剂，置于暗处染色20 min后取出，吸除多余的染色剂，分别取无菌型及消毒型医用超声耦合剂均匀涂布于无菌滤纸片上并放置于固化的琼脂层上，样品约覆盖细胞层表面十分之一，阴性对照选用直径约5 mm、厚约2 mm的高密度聚乙烯圆片，阳性对照选用直径约5 mm用20%苯酚溶液浸湿的医用明胶海绵，置CO2培养箱中继续培养24 h后于倒置显微镜下观察细胞溶解及褪色的情况，并对细胞毒性的级别进行判定。

1.3 数据处理

数据以平均值±标准误（Mean±SEM）表示，用计算机统计软件包Statistica对数据作Students’t检验，确定差异显著性。

2 结果

2.1 MTT（四唑盐）比色法

表1、表2分别为无菌型医用超声耦合剂在不同的浸提比例情况下，不同接种密度对L-929细胞增殖度的影响与细胞毒性的级别。由表1可以看出，在细胞接种密度为104U/mL时，超声耦合剂对L-929细胞的增殖率存在影响。在浸提比例为1 mg/mL、5 mg/mL时，细胞毒性反应为1级、2级，而当浸提比例超过5 mg/mL时，耦合剂对细胞的毒性作用极其显著，达到3、4级。表2显示，当细胞密度为105U/mL时，浸提比例达200 mg/mL时，无菌型超声耦合剂才对细胞有显著的毒性作用，细胞毒性达3级。

表1 医用超声耦合剂的细胞相对增殖率(细胞接种密度:1×104 U/mL)Tab.1 RGR of medical ultrasonic couplant (Inoculum density:1×104 U/mL)

表2 医用超声耦合剂的细胞相对增殖率（细胞接种密度：1×105 U/mL）Tab.2 RGR of medical ultrasonic couplant (Inoculum density:1×105 U/mL)

2.2 琼脂覆盖法

表3显示，用琼脂覆盖法检测无菌型医用超声耦合剂的细胞毒性为1级。

表3 医用超声耦合剂琼脂覆盖法结果Tab.3 Results of medical ultrasonic couplant for agar diffusion test

3 讨论

临床操作中，普通(外用)耦合剂需与皮肤、探头辐射面密切接触，故除声学特性外，耦合剂还须满足不刺激皮肤、不损坏探头、不脏污衣物的要求。随着医学的发展，医用超声耦合剂的配方已几经更新换代，现国内正式生产的产品多为卡波姆凝胶型，除了在完好皮肤上使用的通用型制剂外，还有用于腔内和术中的无菌型凝胶制剂，少数企业已研制生产了消毒型制剂。为了保证临床使用的安全性，新版的医用超声耦合剂标准按照生物学评价的思路，将老版本上的“卫生要求”改为了“生物相容性”，分别对细胞毒性、皮肤致敏和刺激作出了要求。可见，医疗器械生物安全性评价在产品性能指标中占有十分重要的地位。标准中要求用直接接触法检测耦合剂的细胞毒性，但是该方法对材料的要求较高，耦合剂产品为凝胶状无固定形状，并且具有一定的水溶性，故采用该方法在实际操作中会出现很多问题。

本试验采用的MTT比色法是浸提液法的一种，用于细胞毒性的定性和定量评价，该法对受试材料溶出物的毒性检测敏感性较高，也比较符合动物体内的毒性试验结果[2]。结果显示，医用超声耦合剂对L-929细胞具有毒性作用，且与其产品类型及添加成份相关，并表现出一定的剂量依赖性。利用MTT法检测耦合剂的细胞毒性时，同一浸提比例的试验结果在不同的细胞接种密度及作用时间下显示出较为明显的差异。如在浸提比例为1 mg/mL、5 mg/mL及25 mg/mL时，细胞接种密度为1×104U/mL、作用时间为72 h无菌医用超声耦合剂的细胞毒性分别为1、2、3级，而密度为1×105U/mL、作用时间为24 h均未表现出细胞毒性。这些结果提示，细胞毒性检测结果与浸提液制备方法、细胞接种密度以及浸提液作用时间密切相关。浸提液制备方法直接决定了作用于细胞的毒性物质的多少，而细胞接种密度关系到细胞对一定量的毒性物质的敏感程度。本研究试验结果显示，在同一浸提比例下，细胞接种密度大的所反映出的毒性作用小，即高接种密度降低了细胞对毒性的敏感程度。当毒性物质的量一定而细胞接种密度适宜时，作用时间越长，试验组与空白对照组的正常细胞差距越大，表现出的毒性作用越明显。

本试验采用的另一种方法琼脂覆盖法是间接接触法的一种，该方法对材料的要求比直接接触法低，使用的材料范围广，其缺点是受溶出物在琼脂上扩散程度的影响，当溶出物分子量小，易溶于水，其敏感性就高，反之则低[2]。该方法是一种定性评价方法，在结果判定时褪色区域的大小及溶解细胞的比例都是通过试验者的观察实现的，受到一定的主观影响。在本试验中，结果显示该无菌型耦合剂体外细胞毒性为1级，但不能对其结果作出量化的比较。

由此可见，各类型细胞毒性检测试验的原理与方法各不相同，而各方法中又有很多影响检测结果的参数，根据试验材料本身的理化性质、毒性作用强弱及其用途正确的选择试验方法及相关参数十分重要。孙皎认为，生物学评价试验的现行标准不完善，生物学评价试验的方法和评判依据主要参照现行的相关标准文件，而标准推荐的方法并非一定代表当今生物学和医学领域中最先进、最有效和最适合的检测手段[5]。对于医用超声耦合剂产品而言，如何更科学、更准确的评判其细胞毒性的方法尚有待进一步的研究和明确。

[1] 国家食品药品监督管理局.YY0299-2008 医用超声耦合剂[S].

[2] 贾文英,史弘道.细胞毒性试验评价医用装置生物相容性的研究概况[J].实用美容整形外科杂志,2001,12(5):253-255.

[3] 由少华.解读GB/T 16886《医疗器械生物学评价》系列标准[J].中国医疗器械信息,2005,11(1):15-19.

[4] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T16886.5-2003 医疗器械生物学评价第5部分体外细胞毒性试验[S].

[5] 孙皎.医疗器械的生物学评价与风险探讨[J].中国医疗器械杂志,2006,30(5):386-387.