胰岛素降低海马谷氨酸和D-丝氨酸含量改善糖尿病大鼠空间学习记忆能力

杨 菁，杨 岳，宋 扬，杨清俊，李宗泽，张永兴，王洪新

(1.辽宁医学院辽宁省心脑血管药物基础研究重点实验室，辽宁锦州 121001;2.中国医科大学七年制96期，辽宁沈阳 110001;3.厦门大学医学院，福建厦门 363000)

糖尿病是一种以血糖升高为特征的代谢紊乱综合征，发病率逐年上升，我国每年约增加120万糖尿病患者[1]，已经成为糖尿病第一大国。糖尿病导致的学习记忆损伤早在20世纪20年代就有报道[2]。在临床表现中表现为认知功能障碍、痴呆和精神性疾患等慢性脑病症状，称为糖尿病性脑病(diabetic encephalopathy，DE)[3－5]。已发现 DE与大脑微血管病变[6]、氧化应激[7]和非酶性蛋白糖基化[8]等有关，但其发病机制还不明确。

N-甲 基-D-门 冬 氨 酸 (N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体在突触可塑性及兴奋毒性等方面均具有重要作用。NMDA受体NR1亚基上存在一个“甘氨酸位点”，该位点必须被结合后谷氨酸才能开放NMDA受体偶联的离子通道。而研究表明，D-丝氨酸与甘氨酸结合位点的结合效能比甘氨酸的更高，是真正的NMDA受体的共激活因子[9－10]。NMDA受体的过度激活可导致学习记忆损伤。本研究采用尾静脉注射链脲佐菌素(streptotocin，STZ)制备糖尿病模型，观察胰岛素治疗对糖尿病大鼠空间学习记忆能力的影响，并测定海马组织中谷氨酸及D-丝氨酸含量变化，探讨胰岛素的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、药品和主要仪器

健康雄性SD大鼠，体质量190～210 g，由辽宁医学院实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(辽)2003-2010。谷氨酸对照品，上海康达氨基酸厂生产，纯度为99.9%。D-丝氨酸(纯度99.9%)、邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde，OPA)、N-异丁酰基-D-半胱氨酸(N-isobutyryl-D-cysteine，IBDC)和 STZ为 美 国Sigma公司产品。精蛋白锌胰岛素注射液(长效胰岛素，10 ml∶400 U)，江苏万邦生化医药股份有限公式生产。乙腈和甲醇为色谱纯;其余试剂均为国产分析纯。LC-10Avp高效液相色谱仪，为日本岛津公司生产。Morris水迷宫，中国医学科学院药物研究所研制。One TouchⅡ血糖仪，美国强生有限公司产品。

1.2 模型制备、动物分组和药物治疗

45只大鼠适应性喂养3 d后，置于Morris水迷宫中学习训练2 d。于第3天，选择4次均能在90 s内找到平台的43只大鼠为合格实验动物。合格大鼠自由觅食饮水，再喂养3 d后，随机选出10只为正常对照组。余下的大鼠禁食不禁水12 h，一次性尾静脉给予STZ 50 mg·kg－1(STZ临用前溶解于新鲜配制的0.1 mol·L－1，pH 4.4 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，配制成1%的溶液)，记为第0天(d 0)。72 h后由尾静脉采血测定血糖，选择血糖≥15.0 mmol·L－1者为糖尿病大鼠[11]。将复制成功的糖尿病大鼠再用随机法分为2组:糖尿病模型组16只;胰岛素治疗组13只，每日下午5～6时腹部sc给予胰岛素，并于次日上午8～9时检测血糖，调整胰岛素用量，使大鼠血糖控制在 6～9 mmol·L－1，胰岛素用量约为每天2 U·kg－1。正常对照组腹部皮下给予等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。所有大鼠均自由摄食摄水，12 h光照，连续给药82 d。

1.3 大鼠体质量和血糖的测定

每周定期测定1次大鼠体质量。定期检测大鼠空腹血糖，尾静脉采血，用血糖仪测定。

1.4 Morris水迷宫实验

参照Morris方法[12]于第81天进行大鼠水迷宫实验。记录大鼠寻找平台并爬上平台所需时间(逃避潜伏期)和计算大鼠在原平台象限游泳时间占总游泳时间的百分比。实验期间继续给药。

1.5 HE染色观察海马CA1区神经细胞形态

Morris水迷宫实验结束后，用10%水合氯醛300 mg·kg－1腹腔注射，麻醉后开胸暴露心脏，经左心室插管灌流生理盐水，剪开右心房，待心脏变白后改用4%多聚甲醛灌流固定，取脑组织，固定于10%甲醛中，石蜡包埋切片，经HE染色后光镜下观察海马CA1区神经细胞形态变化。

1.6 高效液相色谱法检测海马组织中谷氨酸和D-丝氨酸含量[13－14]

水迷宫实验完成后立即取双侧海马，冻存，5 d内用邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde，OPA)柱前衍生化高效液相色谱法测定谷氨酸和D-丝氨酸含量(mg·g－1湿重)。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 胰岛素对糖尿病大鼠体质量和血糖的影响

表1及表2结果显示，正常对照组大鼠体质量增长明显，血糖维持正常水平，而糖尿病模型组大鼠体质量增长缓慢或下降，血糖一直处于较高水平(血糖≥15.0 mmol·L－1)，与正常对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.01)。胰岛素治疗组大鼠体质量增加明显，血糖也恢复到正常水平(表2)。

2.2 胰岛素对糖尿病大鼠空间学习记忆的影响

表3结果表明，糖尿病模型组大鼠逃避潜伏期较正常对照组明显延长，且在原平台象限游泳时间占总游泳时间的百分比明显降低(P＜0.01)，表明糖尿病大鼠空间学习记忆功能明显受损(P＜0.01)。胰岛素治疗组逃避潜伏期较糖尿病模型组明显缩短(P＜0.01)，大鼠在原平台象限的游泳时间占总游泳时间的百分比明显增加(P＜0.01)，表明胰岛素可以明显改善糖尿病大鼠的学习记忆能力(表3)。

Tab.1 Effect of insulin on body mass in diabetes mellitus(DM)rats

Tab.2 Effect of insulin on blood glucose in DM rats

Tab.3 Effect of insulin on escape latency and percentage of time spent in target quadrant of DM rats

2.3 胰岛素对糖尿病大鼠海马组织病理变化的影响

从海马冠状切片HE染色可见，正常对照组(图1A)、糖尿病模型组(图1B)、胰岛素治疗组(图1C)光镜下海马CA1区锥体细胞均排列整齐、密集;神经元形态完整，胞核染色清晰，核圆形或椭圆形，核仁明显。

Fig.1 Effect of insulin on pyramidal neurons in hippocampal CA1 regions of DM rats(HE staining ×400).See Tab.1 for the rat treatment.A:control group;B:DM model group;C:DM model+insulin group.

2.4 胰岛素对糖尿病大鼠海马组织中谷氨酸和D-丝氨酸含量的影响

表4结果表明，与正常对照组相比，糖尿病模型组海马组织谷氨酸及D-丝氨酸含量都明显升高(均P＜0.01)。与糖尿病模型组相比，胰岛素治疗组海马组织中谷氨酸及D-丝氨酸含量均显著降低(P＜0.01)，与正常对照组相比无显著性差异。

Tab.4 Effect of insulin on levels of glutamate(Glu)and D-serine(D-Ser)in hippocampus of DM rats

3 讨论

本研究结果表明，胰岛素能够使糖尿病大鼠血糖恢复到正常水平，体质量也逐渐增加，大鼠无多饮多尿现象。注射STZ第81天进行水迷宫实验，与糖尿病模型组相比，胰岛素治疗组逃避潜伏期明显缩短，原平台象限游泳时间占总游泳时间的百分比明显升高，表明胰岛素对STZ诱导的大鼠学习记忆损伤具有治疗作用，该结果与文献报道结果基本一致[11]。

NMDA受体是谷氨酸受体的一种亚型，介导多种生理病理变化，其激活需要谷氨酸及D-丝氨酸共同参与。本研究还测定了海马组织中这2种氨基酸含量，结果表明糖尿病模型组海马组织中谷氨酸和D-丝氨酸分别是正常对照组的1.39和1.35倍。有文献报道，糖尿病大鼠谷氨酸生成量增加[15]，与本研究结果基本一致。D-丝氨酸作为哺乳动物体内最主要的D型氨基酸之一，达到了体内游离丝氨基酸总量的三分之一。在体内D-丝氨酸主要由丝氨酸消旋酶将体内的L-丝氨酸转化而来[10]。有文献报道，腹腔注射STZ具有提高视网膜丝氨酸消旋酶活性和D-丝氨酸含量的作用[16]，因此推断STZ在脑组织中也可能通过同样的机制来提高脑海马组织中的D-丝氨酸含量。谷氨酸和D-丝氨酸在激活NMDA 受体过程中发挥关键性作用[9－10，17]。研究报道，NMDA受体上甘氨酸位点并不饱和[18]，并且能够被外源性D-丝氨酸进一步激活[19]，因此推测糖尿病模型大鼠学习记忆损伤可能与大鼠海马组织中谷氨酸及D-丝氨酸含量升高、引起NMDA受体过度兴奋有关。而胰岛素对糖尿病大鼠学习记忆的治疗作用可能是通过降低海马组织中谷氨酸和D-丝氨酸的浓度，进而发挥了治疗作用。

[1]Yang W，Lu J，Weng J，Jia W，Ji L，Xiao J，et al.Prevalence of diabetes among men and women in China[J].N Engl J Med，2010，362(12):1090-1101.

[2]Miles WR，Root HF.Psychologic tests applied to diabetic patients[J].Arch Int Med，1922，30:767-777.

[3]Sima AA.Encephalopathies:the emerging diabetic complications[J].Acta Diabetol，2010，47(4):279-293.

[4]Ding J，Strachan MW，Reynolds RM，Frier BM，Deary IJ，Fowkes FG，et al.Diabetic retinopathy and cognitive decline in older people with type 2 diabetes:the Edinburgh type 2 diabetes study[J].Diabetes，2010，59(11):2883-2889.

[5]Strachan MW，Frier BM，Deary IJ.Type 2 diabetes and cognitive impairment[J].Diabet Med，2003，20(1):1-2.

[6]Wessels AM， Rombouts SA， Simsek S， Kuijer JP，Kostense PJ，Barkhof F，et al.Microvascular disease in type 1 diabetes alters brain activation:a functional magnetic resonance imaging study[J].Diabetes，2006，55(2):334-340.

[7]Hsieh RH， Lien LM， Lin SH， Chen CW，Cheng HJ，Cheng HH.Alleviation of oxidative damage in multiple tissues in rats with streptozotocin-induced diabetes by rice bran oil supplementation[J].Ann N Y Acad Sci，2005，1042:365-371.

[8]Tomlinson DR，Gardiner NJ.Glucose neurotoxicity[J].Nat Rev Neurosci，2008，9(1):36-45.

[9]Henneberger C， Papouin T， Oliet SH， Rusakov DA.Long-term potentiation depends on release of D-serine from astrocytes[J].Nature，2010，463(7278):232-236.

[10]Pollegioni L，Sacchi S.Metabolism of the neuromodulator D-serine[J].Cell Mol Life Sci，2010，67(14):2387-2404.

[11]Biessels GJ，Kamal A，Urban IJ，Spruijt BM，Erkelens DW，Gispen WH.Water maze learning and hippocampal synaptic plasticity in streptozotocin-diabetic rats:effects of insulin treatment[J].Brain Res，1998，800(1):125-135.

[12]Morris R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat[J].J Neurosci Methods，1984，11(1):47-60.

[13]Grant SL， Shulman Y， Tibbo P， Hampson DR，Baker GB.Determination of D-serine and related neuroactive amino acids in human plasma by high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2006，844(2):278-282.

[14]Pang L， Yang Y， Yang J， Song Y，Yu T，Yang QJ，et al.Effect of high glucose on glutamate release and ingestion of astrocytes stimulated by high K+in rats[J].Chin J Pharmacol Toxicol(中国药理学与毒理学杂志)，2012，26(2):163-167.

[15]García-Espinosa MA，García-Martín ML，Cerdán S.Role of glial metabolism in diabetic encephalopathy as detected by high resolution13C NMR[J].NMR Biomed，2003，16(6-7):440-449.

[16]Jiang H，Fang J，Wu B，Yin G，Sun L，Qu J，et al.Overexpression of serine racemase in retina and overproduction of D-serine in eyes of streptozotocin-induced diabetic retinopathy[J].J Neuroinflammation，2011，8:119.

[17]Zorumski CF，Izumi Y.NMDA receptors and metaplasticity:mechanisms and possible roles in neuropsychiatric disorders[J].Neurosci Biobehav Rev，2012，36(3):989-1000.

[18]Chen L， Muhlhauser M， Yang CR.Glycine tranporter-1 blockade potentiates NMDA-mediated responses in rat prefrontal cortical neurons in vitro and in vivo[J].J Neurophysiol，2003，89(2):691-703.

[19]Martina M， Krasteniakov NV， Bergeron R.D-Serine differently modulates NMDA receptor function in rat CA1 hippocampal pyramidal cells and interneurons[J].J Physiol，2003，548(Pt 2):411-423.