注射用灯盏花素对大鼠和犬的毒性病理学比较

刘向云，王 永，李 雷，许 丽，苏 欣，桂 博，周 莉，孙祖越

(上海市计划生育科学研究所药理毒理学研究室，中国生育调节药物毒理学检测中心，上海 200032)

灯盏花素是从灯盏细辛中提取的活性成分，主要活性单体为灯盏乙素，具有扩张微细血管和降低血液黏稠度的作用;能降低脑血管阻力、增加脑血流量和改善微循环，可用于脑血管病的治疗［1］。为确定增加灯盏花素用药剂量的安全性，从毒性病理学方面，观察其毒性作用靶器官并探讨不同种属动物对同一药物毒性反应的差异，本研究采用了SD大鼠和比格犬分别给予灯盏花素后进行体内毒性比较研究，为临床用药提供比较毒性病理实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和仪器

注射用灯盏花素，批号:20100127，为淡黄色至黄色的疏松块状物，由昆明龙津药业股份有限公司提供。含量按平均装量计算，为标示量的98.74%，用氯化钠注射液配制。苏木素、伊红(HE)染料，10%甲醛固定液，购自德国Leica公司。RM2126石蜡切片机，为德国Leica公司产品;Nikon-50i显微镜，上海衡浩仪器有限公司等。

1.2 动物

SD大鼠，120只、雌雄各半、5～6周龄、体质量100～140 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物合格证号:动物生产许可证SCXK(沪)2008-0016;动物使用许可证号:SYXK(沪)2008-0027;在上海市计划生育科学研究所(中国生育调节药物毒理检测中心)SPF级动物房内饲养，饲养于400 mm×350 mm×200 mm塑料笼内，每笼饲养同性大鼠5只，自由饮水、摄食。室温20～26℃，相对湿度40% ～70%，光照12 h，黑暗12 h。

比格犬，24只、雌雄各半、6～12个月龄、体质量7.0～10.0 kg。由上海新冈实验动物场提供，动物合格证号:SCXK(沪)2007-0009;动物使用许可证号:SYXK(沪)2008-0027;动物饲养在上海市计划生育科学研究所(中国生育调节药物毒理检测中心)大动物(犬、猴)实验室，饲养于不锈钢笼内，每笼1只;每天每只动物喂犬专用饲料250 g左右。上、下午各喂食1次，自由饮水;室温18～28℃，相对湿度40% ～70%，空调通风，光照明暗各12 h。

1.3 SD大鼠分组给药

实验开始前适应性饲养5 d，用标准饲料喂养。经一般行为观察，选用符合要求大鼠进入实验。大鼠随机分为4组，每组30只，雌雄各半，分别为注射用灯盏花素30，60和120 mg·kg－1组及溶媒对照组，为临床使用剂量的37.5，75和150倍。大鼠按照5 ml·kg－1，尾iv给予注射用灯盏花素30，60和120 mg·kg－1，每天1 次、共3 个月，恢复期(停止给药)观察1个月。分别于最后1次给药24 h后(每组20只大鼠)和停药1个月后(剩余大鼠)麻醉、解剖。

1.4 比格犬分组给药

比格犬实验开始前适应性饲养14 d，用标准饲料喂养。经一般行为观察，选用符合要求比格犬进入实验。24只，雌雄各半，分别按体质量随机分为4组，每组6只动物，分别为注射用灯盏花素25，50和100 mg·kg－1组和溶媒对照组，分别为临床使用剂量的30，60和120倍。按照2 ml·kg－1比格犬iv给予灯盏花素25，50和100 mg·kg－1，每天1 次，共3个月，恢复期(停止给药)观察1个月。分别于最后1次给药24 h后(每组4只犬)和停药1个月后(剩余犬)麻醉、解剖。

1.5 HE染色和病理学观察

大鼠或比格犬iv给予3%戊巴比妥钠约1.0 ml·kg－1iv 麻醉，放血处死后解剖取材［2］。详细观察大脑、小脑、骨髓、甲状腺、唾液腺、肾上腺、胰腺、气管、心、肺、睾丸、附睾、子宫、卵巢、脾和淋巴结情况并记录所有阳性病变，组织取材固定于10%甲醛固定液中，包埋、切片及HE染色。所有组织脱水后常规包埋，修块切片，每张切片厚度约3 μm，烘干后用自动染色机进行HE染色、封边。在光学显微镜下对大鼠和比格犬组织进行观察、比较。

1.6 统计学分析

采用SPSS11.0统计软件对检测结果进行统计学分析。

2 结果

2.1 注射用灯盏花素对SD大鼠和比格犬神经系统病理的影响

如图1所示，大鼠和犬中镜下观察均显示神经系统相关组织无明显异常改变(图1)。大鼠灯盏花素30，60和 120 mg·kg－1以及比格犬 25，50 和100 mg·kg－1组给药期及恢复期大脑脂质体均软脑膜完整，皮质和髓质未见明显病变(图1A和E);小脑皮质分子层、浦肯野层和颗粒层细胞结构清楚，均未见明显病变(图1B和F);脊髓灰质和白质分界清楚，角细胞内可见粗大的尼氏体，均未见明显异常(图1C和G)。垂体前、中和后叶结构清晰，未见明显病变(图1D和H)。

Fig.1 Effect of breviscapine on pathology of nervous system in rats and dogs(HE ×100).Rats were iv injected breviscapine 30，60 and 120 mg·kg －1，once daily，for 3 months.Dogs were iv given breviscapine 25，50 and 100 mg·kg－1，once daily，for 3 month，and recovered for 1 month.A，B，C and D:cerebrum，cerebellum，spinal cord and hypophysis in rats in breviscapine 120 mg·kg－1group，respectively.E，F，G and H:cerebrum，cerebellum，spinal cord and hypophysis in dogs in breviscapine 100 mg·kg－1group，respectively.

2.2 注射用灯盏花素对SD大鼠和比格犬内分泌系统病理的影响

由图2大鼠和犬中镜下观察结果可见，内分泌系统相关脏器无明显异常改变。大鼠灯盏花素30，60和120 mg·kg－1以及比格犬25，50 和100 mg·kg－1组给药期及恢复期甲状腺均未见明显病变，滤泡结构清晰，腔内充满胶体(图2A和E);甲状旁腺均未见明显病变(图2B和F);唾液腺均未见明显病变，腺体以小期叶状分布，结构清晰(图2C和G);各剂量组给药期及恢复期肾上腺皮质三带结构清楚，髓质细胞正常，未见明显病变;胰腺结构完整、清晰，外分泌部的导管及腺泡未见病变，腺泡内可见胰岛分布，均未见明显病变(图2D和H)。

Fig.2 Effect of breviscapine on pathology in endocrine system in rats and dogs(HE ×100).See Fig.1 for rat and dog treatment.A，B，C and D:normal thyroid，parathyroid，sialaden and adrenal gland in rats in breviscapine 120 mg·kg－1group，respectively.E，F，G and H:normal thyroid，parathyroid，sialaden and adrenal gland in dogs in breviscapine 100 mg·kg－1group，respectively.

2.3 注射用灯盏花素对SD大鼠和比格犬消化系统病理的影响

大鼠的镜下观察结果，均显示肝和胃结构清晰，无明显异常改变(图3A和B)。犬的镜下观察结果，灯盏花素100 mg·kg－1组1只雌性犬胃黏膜细胞轻度水肿(图3D)。其余各剂量组给药期及恢复期胃黏膜被覆黏膜上皮，可见各种腺细胞，未见明显病变。注射用灯盏花素100 mg·kg－1组给药期1只雌性犬肝可见多处小肉芽肿性炎症，汇管区轻度纤维化，注射用灯盏花素50 mg·kg－1组1只雌性犬可见多处小肉芽肿性炎症(图3F);灯盏花素100 mg·kg－1组 1 只雄性犬肝窦扩张，中度淤血(图3G);犬注射用灯盏花素25，50 和100 mg·kg－1组给药期及恢复期肝小叶均结构清晰，肝细胞以中央静脉为中心反射状排列，未见明显病变。

2.4 注射用灯盏花素对SD大鼠和比格犬的泌尿系统病理的影响

大鼠的镜下观察结果，均显示膀胱和肾结构清晰，无明显异常改变(图4A和B)。犬的镜下观察结果，注射用灯盏花素各剂量组膀胱在给药期及恢复期均结构清晰，未见明显病变(图4C);肾小管给药期及恢复期均未见明显病变(图4D);给药期注射用灯盏花素100 mg·kg－1组1只雄性犬肾近端肾小管细胞重度肿胀，管腔消失(图4E);给药期注射用灯盏花素100 mg·kg－1组1只雌性犬肾小管细胞均脱落至管腔(图4F)。

Fig.3 Effect of breviscapine on pathology in digestive system in rats and dogs(HE ×100).See Fig.1 for rat and dog treatment.A and B:liver and stomach in rats in breviscapine 120 mg·kg－1group，respectively.C，D:liver and stamoch in dogs in breviscapine 100 mg·kg－1group.E:liver fibrosis in one dog in breviscapine 100 mg·kg－1group.F:granulomatous inflammation of liver in one dog in breviscapine 50 mg·kg－1group.G，H:congestion of liver and gastric mucosa edema in one dog in breviscapine 100 mg·kg－1group，respectively.

Fig.4 Effect of breviscapine on pathology of endocrine system in rats and dogs(HE ×100).See Fig.1 for rat and dog treatment.A and B:bladder and kidney in rats in breviscapine 120 mg·kg －1group，respectively.C and D:bladder，kidney in one dog in breviscapine 100 mg·kg －1group;E and F:kidney tubules edema and malpighian tube skin cells falling off in one dog in breviscapine 100 mg·kg －1，respectively.

2.5 注射用灯盏花素对SD大鼠和比格犬的心脏和呼吸系统病理的影响

大鼠的镜下观察结果显示，注射用灯盏花素30，60 和120 mg·kg－1组均显示气管、肺和心结构清晰，无明显异常改变(图5A，B和C)。犬的镜下观察结果显示，犬注射用灯盏花素 25，50和100 mg·kg－1组给药期及恢复期气管均未见明显病变(图5D)。注射用灯盏花素100 mg·kg－1组1只雄性犬肺泡腔消失，大量炎症细胞浸润，肺实变(图5E);注射用灯盏花素25，50和100 mg·kg－1组1只雌性犬肺泡腔萎陷，腔内充满脱离上皮细胞(图5H)，其余各剂量组给药期及恢复期均未见明显病变;各剂量组给药期及恢复期心肌纤维、心内膜和心外膜均未见明显病变(图5F和G)。

Fig.5 Effect of breviscapineon toxicity pathology of breath and cardiovascular systemsin ratsand dogs(HE ×100).See Fig.1 for rat and dog treatment.A，B and C:trachea，lungs，and heart in rats in breviscapine 120 mg·kg－1group，respectively.D，E and F:trachea，lung and heart in dogs in breviscapine 100 mg·kg －1group.G and H:pneumonia and collapsed pulmonary alveoli in breviscapine 100 mg·kg－1group，respectively.

2.6 注射用灯盏花素对SD大鼠和比格犬的生殖系统病理的影响

大鼠和犬中镜下观察结果均显示，生殖系统相关脏器无明显异常改变(图6)。大鼠注射用灯盏花素30，60和120 mg·kg－1组及犬注射用灯盏花素25，50 和100 mg·kg－1组给药期及恢复期睾丸、附睾(雄性)(图 6A，B，E和 F)、子宫和卵巢(雌性)(图6C，D，G和H)结构清晰，均未见明显病变。

2.7 注射用灯盏花素对SD大鼠和比格犬的免疫系统病理的影响

如图7所示，大鼠的镜下观察结果显示，免疫系统结构清晰，无明显异常改变(图7A和B)。犬的镜下观察结果，给药期注射用灯盏花素100 mg·kg－1组 1只雌性犬和注射用灯盏花素25 mg·kg－1组1只雄性犬脾重度淤血，皮髓质结构不清(图7E和F);注射用灯盏花素100 mg·kg－1组1只雌性犬肠系膜淋巴结皮、髓质分界不清、血管扩张、淤血;注射用灯盏花素100 mg·kg－1组1只雄性犬给药局部淋巴结内可见少量棕黄色颗粒沉淀(图7G和H);其余注射用灯盏花素各剂量组给药期及恢复期未见明显病变(图7C和D)。

Fig.6 Effect of breviscapine on pathology of reproductive system in rats and dogs(HE ×100).A，B，C and D:testicle，epididymis，ovary and uterus in rats groups，respectively.E，F，G and H:testicles，epididymes，ovary and uterus in dogs in breviscapine 100 mg·kg －1groups，respectively.

Fig.7 Effect of breviscapine on pathology of immune system in rats and dogs(HE ×100).A and B:normal lymphonodes and spleen in rats in breviscapine 120 mg·kg －1;C and D:normal lymphnodes and spleen in dogs in breviscapine 100 mg·kg －1groups，respectively.E and F:spleen congestion in one dog in breviscapine 100 mg·kg －1and 25 mg·kg －1groups，respectively;G and H:a small amount of tan in lymphnodes precipitation in one dog in breviscapine 100 mg·kg －1and 25 mg·kg －1groups，respectively.

3 讨论

肝、肾、脾和肺是药物毒性作用最常见的靶器官［3］，目前这些重要脏器毒性作用的判断主要依靠血生化、血液学、尿及病理形态观察，当尿及血液学未出现改变，或尿及血液学检测不准确，或不能反映重要脏器损伤时，则必须依靠病理检查。不同种属动物，其脏器结构存在一定的差异性，在药物毒性的反应上也不尽相同。本研究中注射用灯盏花素对SD大鼠给药期和停药恢复期各剂量组未见明显器官毒性，而对比格犬出现了肝、胃、肾、肺、脾和淋巴结等不同程度的损害，其中脾和淋巴结淤血可能是由于动物麻醉处死时放血不彻底造成的。脏器的异常改变说明不同动物对注射用灯盏花素素的耐受性、敏感性和毒性反应存在种属差异［4］，停药1个月后基本可以恢复正常。徐勤等［5－7］研究发现，比格犬和SD大鼠肝、脾和肾存在结构上的差异。比格犬肝小叶中央静脉间距大于SD大鼠肝小叶中央静脉间距;比格犬中央静脉和汇管区间距同样大于SD大鼠的中央静脉-汇管区间距［5］。比格犬近髓肾单位大于皮质肾单位，而SD大鼠近髓肾单位及皮质肾单位大小无显著性差异。比格犬肾小球较SD大鼠肾小球稍大［6］。比格犬脾小结中央动脉周围淋巴鞘及脾小体帽区厚度均大于SD大鼠，但性别对犬及大鼠各组织形态参数无影响［7］。这些脏器结构的不同可能是造成药物对实验动物种属差异的原因之一。

肝和肾对药物代谢起着重要作用，尽管有很多体外替代实验，但是并不能完全替代药物在机体中的代谢过程。Grime等［8］对22种药进行了大鼠、犬和人体内代谢过程的比较研究，发现肝对药物的代谢率存在明显的种属差异。同样，由于不同的血浆蛋白结合率和肾血流量，药物在犬的肾清除率也有着明显差异［9］。亦有研究发现，淋巴液的转运尽管在不同种属的动物体内过程较为相似，但是对某些需要淋巴液转运的药物，小动物的药物转运效率较低［10］。由于不同种属动物体内的脏器结构、代谢率和药物转运效率的差异，某些药物在不同种属动物体内会出现不同的毒性病理结果。注射用灯盏花素在大鼠的长期毒性实验中没有明显的脏器毒性，但在犬的长期毒性实验中出现了个别动物个别脏器的毒性，说明注射用灯盏花素对脏器毒性反应存在种属差异，具体毒性机制仍需进一步研究。

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